脓肿分枝杆菌erm基因启动子区突变诱导克拉霉素耐药性改变的机制研究

The incidence of non-tuberculous mycobacteria diseases has been rising trend year by year in China. Mycobacterium abscess is the second isolation rate of non-tuberculous mycobacteria strain with the highest-level drug resistance. The investigation of the mechanism involved in mycobacterium abscess resistance on clarithromycin is important to make clinical treatment strategy. In our previous work, we firstly proved that the erm(41) T28 type of Mycobacterium abscess as a new genotype, which affect its phenotype shown without resistance on clarithromycin. Based on the special genotype of erm(41) T28 in mycobacterium abscess strain, we screen the pheno type of these strain by drug susceptibility test in vitro, identify the promotor zone gene mutation site by sequencing analysis, construct a luciferase reporter gene vector system and setup an bioinformatics method for evaluation the transcription factor function, and identify the target transcription factor by HPLC-MS. The full-scale investigation of promotor zone of erm(41) gene in Mycobacterium abscess may provide a well understanding of mechanism of induced drug resistance on clarithromycin.

我国非结核分枝杆菌发病呈明显上升态势，其中脓肿分枝杆菌是耐药性最强的非结核分枝杆菌，其对克拉霉素耐药机制的深入研究对临床治疗决策的制定具有重要意义。课题组前期工作中，首次发现存在erm（41）T28序列型无诱导耐药的脓肿分枝杆菌，即一种新的对表型有影响的基因型。本课题以该序列型脓肿分枝杆菌为研究对象，通过体外药敏实验筛选无诱导耐药的脓肿分枝杆菌；通过对其启动子区的序列分析，鉴定可能导致erm（41）无诱导耐药的突变位点；进而构建启动子荧光素酶报告基因载体系统，验证上述启动子突变在erm（41）转录中的重要作用，并通过分子生物学和生物信息学技术，对启动子进行鉴定和功能研究，明确上述特殊菌株的erm（41）基因启动子区的序列信息，阐明脓肿分枝杆菌克拉霉素诱导耐药过程中erm（41）基因启动子区转录水平的调控机制，为全面理解脓肿分枝杆菌乃至其他非结核分枝杆菌对克拉霉素的耐药机制提供重要的依据。

我国非结核分枝杆菌发病呈明显上升态势，其中脓肿分枝杆菌是非结核分枝杆菌中分离率第二，且耐药性最强的非结核分枝杆菌。脓肿分枝杆菌对一线抗结核药物天然耐药，对普通抗菌药物多不敏感。克拉霉素是治疗脓肿分枝杆菌病的最重要药物，但近期研究发现脓肿分枝杆菌对克拉霉素的耐药率呈显著上升趋势。因此，对其进行克拉霉素耐药机制的深入研究对临床治疗决策的制定具有重要意义。课题组前期工作中，首次发现存在erm（41）T28序列型无诱导耐药的脓肿分枝杆菌，即一种新的对表型有影响的基因型。本课题以该序列型脓肿分枝杆菌为研究对象，通过体外药敏实验筛选无诱导耐药的脓肿分枝杆菌；并对其启动子区的序列分析，鉴定可能导致erm（41）无诱导耐药的突变位点；进而构建启动子荧光素酶报告基因载体系统，验证上述启动子突变在erm（41）转录中的重要作用，并通过分子生物学和生物信息学技术，对启动子进行鉴定和功能研究，明确上述特殊菌株的erm（41）基因启动子区的序列信息，阐明脓肿分枝杆菌克拉霉素诱导耐药过程中erm（41）基因启动子区转录水平的调控机制，同时建立多基因联合诊断脓肿分枝杆菌临床菌株检测方法。结果显示115株T28序列型脓肿分枝杆菌中有108株（93.9%）表现诱导耐药，其中有7株（6.1%）T28序列型无诱导耐药表型；erm（41）T28序列型无诱导耐药的脓肿分枝杆菌中erm（41）基因启动子区-30位突变导致其转录失活，以及转录因子WhiB7是调控erm（41）启动子区-30位点的关键因子；且联合erm（41）基因启动子区-150区域基因和erm（41）基因检测脓肿分枝杆菌发现敏感菌株的灵敏度为94.1%和特异度98.5%，与药敏方法检测没有统计学意义（х2=0.076，P=0.783）。本课题的实施揭示了脓肿分枝杆菌克拉霉素诱导耐药的调控的新机制以及建立了多基因联合检测脓肿分枝杆菌的方法，将有助于克拉霉素对脓肿分枝杆菌病治疗方案的实施以及对其他非结核分枝杆菌对克拉霉素的耐药机制提供重要的依据。目前已发表文章7篇，其中SCI论文3篇，培养研究生3人。