yrbE基因突变导致脓肿分枝杆菌对克拉霉素耐药的机制研究

The treatment of mycobacterium abscess infection is challenging. Typically clarithromycin plays a central role in the therapy, but the resistance is a serious clinical problem and cannot be fully explained by current known mechanisms. Capitalizing on the resources of our hospital, we have collected a series of clinical isolates of mycobacterium abscess, molecular typing and antimicrobial susceptibility testing were done (Medicine 2016). Through comparative analysis of the whole genome sequence, we observed that yrbE gene mutation (yrbE(Mut)) is related to clarithromycin resistance, and the mechanism might be that yrbE(Mut) regulates the expression of mce operons and ABC transporters and facilitates the extracellular transport of clarithromycin. Using homologous recombination knock-out, RNA sequencing and other approaches, this study intends to find out the regulation of mce operon by yrbE(Mut) and screen for yrbE(Mut)-mce targeted ABC transporter related to clarithromycin resistance. This study will also define the role of "yrbE(Mut)-mce-target ABC transporters” axis, and with further epidemiological studies, define the role of this new mechanism in mycobacterium abscessus clarithromycin resistance, to eventually facilitate the discovery of new therapeutic targets.

脓肿分枝杆菌感染治疗困难，克拉霉素是核心治疗药物，但耐药性的产生是临床难题。目前已知的克拉霉素耐药机制不能完全解释临床菌株的耐药现象。依托所在专科医院的资源优势，申请者前期收集了系列脓肿分枝杆菌临床株并行分子分型及药敏检测（Medicine 2016），通过全基因组测序对比分析首次发现，yrbE基因突变可导致细菌对克拉霉素耐药，推测机制为突变型yrbE（yrbE(Mut)）影响mce操纵子及ABC转运体的表达，促进克拉霉素细胞外转运而导致耐药。本课题拟通过同源重组基因敲除、RNA-seq等方法，探索yrbE(Mut)对mce操纵子的调控作用；筛选受yrbE(Mut)-mce调控，与克拉霉素耐药相关的ABC转运体；明确“yrbE(Mut)-mce-目标ABC转运体”的信号通路；通过进一步的流行病学研究，明确此新机制在脓肿分枝杆菌对克拉霉素耐药中的作用，为临床治疗探索潜在的干预靶点。

脓肿分枝杆菌感染治疗困难，克拉霉素是核心治疗药物，但耐药性的产生是临床难题。目前已知的克拉霉素耐药机制不能完全解释临床菌株的耐药现象。依托所在专科医院的资源优势，申请者前期收集了系列脓肿分枝杆菌临床株，通过菌种鉴定、药敏特性和配套临床资料的收集，建立了脓肿分枝杆菌临床菌株库，完成了全基因组测序（全基因组数据上传NCBI/Genbank）、耐药表型及亲缘进化分析，发现yrbE基因突变与已知耐药机制无法解释的克拉霉素耐药密切相关；通过同源重组基因敲除/回补、药敏检测等方法，明确了yrbE对脓肿分枝杆菌克拉霉素耐药性的影响；通过RNA-seq、序列比对预测筛选了yrbE下游调控的目标ABC转运体，推测MAB_2355c可能参与yrbE基因突变介导的脓肿分枝杆菌对大环内酯类的抗性调节过程；通过进一步的蛋白结构预测分析，重组质粒目标蛋白表达，ATP水解实验，基因敲除和回补，体外转录翻译抑制实验等明确了MAB_2355c的核糖体保护功能；在此基础上，建立了“yrbE(Mut)-MAB_2355c”的信号通路，揭示了yrbE基因通过调控脓肿分枝杆菌ABC-F蛋白 MAB_2355c的表达，影响其核糖体保护功能，进而介导脓肿分枝杆菌对克拉霉素耐药的机制；最后我们分析了该新机制在临床菌株的流行情况，yrbE(Mut)-MAB_2355c介导的克拉霉素耐药在临床菌株中的发生率约为3.1%。本研究首次提出了“yrbE(Mut)-MAB_2355c”的信号通路在脓肿分枝杆菌克拉霉素耐药中的作用及分子机制，对于更全面、深入地认识克拉霉素耐药，为临床治疗探索新的干预靶点，具有重要的临床意义和潜在应用价值。