EpCAM-丹参酮ⅡA纳米粒靶向肝癌干细胞调控Wnt/β-catenin信号通路抗肝癌侵袭转移的机制

Cancer stem cells (CSC) are one of the main resources for liver cancer (LC) relapse and metastasis. Wnt/beta-catenin signaling pathway plays an important role in the origination and development of CSC. Funded by the Youth Grant, we have already successfully generated TanshinoneIIA-nanoparticles (TSIIA-NPs), which inhibited LC cell invasion and metastasis by repressing wnt/beta-catenin/VEGF signaling. In the current application, we propose to first modify TSIIA-NPs by adding EpCAM McAb (EpCAM-TSIIA-NPs) to direct the particles to EpCAM expressing LCSC. We then will study the CSC targeting capability of these particles using laser confocal and LC-MC technologies, as well as their effect on beta-catenin signaling using Q-RT-PCR, western blot and CHIP. This study of ours will elucidate the mechanisms by which EpCAM-TSIIA-NPs inhibit LC metastasis through blocking beta-catenin activation in LCSC, and identify novel therapeutical targets for TCM to treat LC.

肿瘤干细胞是肝癌复发转移的重要根源之一，Wnt/β-catenin信号转导参与了肿瘤干细胞的发生发展，在肝癌复发转移中起重要作用。申请人承担青年基金时成功构建丹参酮IIA纳米能靶向肝癌，并发现丹参酮IIA能抑制Wnt/β-catenin信号通路激活，下调VEGF表达，抑制肝癌侵袭转移。.本研究在前期研究基础上，利用EpCAM McAb的免疫特异性与肝癌干细胞表面EpCAM抗原结合，构建新型EpCAM修饰的丹参酮ⅡA纳米粒，使其特异性地识别肝癌干细胞。测定载药纳米粒对肝癌干细胞的靶向性；利用Q-RT-PCR、WB 及CHIP等技术研究EpCAM-丹参酮ⅡA纳米在肝癌干细胞β-catenin的激活作用及与转录因子TCF、相关靶基因的结合能力，揭示该纳米粒通过Wnt/β-catenin信号通路抑制LCSCs的激活，靶向阻断EpCAM抗肝癌侵袭转移的机制，为中医药治疗肝癌提供新的途径和理论依据。

目 的: 利用EpCAM McAb的免疫特异性与肝癌干细胞表面EpCAM抗原结合，构建新型丹参酮IIA免疫纳米粒，探讨该纳米粒通过Wnt/β-catenin信号通路，靶向抑制肝癌干细胞侵袭转移的机制。.方 法: 采用乳化溶剂蒸发法制备丹参酮IIA免疫纳米粒；扫描电镜评价纳米粒形态、大小；观察丹参酮IIA免疫纳米粒靶向作用。检测流式细胞分选仪分选出的EpCAM+ HepG2肝癌干细胞EpCAM蛋白的表达情况、克隆能力及侵袭转移能力。比较治疗后各组肝癌裸鼠动物模型的肿瘤生长抑制作用、坏死程度、MVD表达、细胞毒性、细胞粘附能力及侵袭转移能力。Westen blot测定β-catenin及其破坏复合物GSK3β、Axin、APC的蛋白表达水平，RT-PCR检测β–catenin信号通路上游因子Wnt1mRNA的影响。.结 果: 丹参酮IIA免疫纳米粒大小均匀，外形圆整，具有较好的靶向作用。EpCAM+ HepG2肝癌干细胞较HepG2肝癌细胞有更强的克隆及侵袭转移能力。体内外实验提示丹参酮IIA免疫纳米粒能有效提高药物的细胞毒性，瘤体体积较其他各组明显减轻(p<0.01)，并加重了肿瘤的坏死程度，坏死程度明显高于其他各组(P<0.01)，能够显著抑制裸鼠人肝癌微血管的形成及体外细胞的粘附率(P<0.01；p <0.05)。划痕实验显示丹参酮IIA免疫纳米粒组较其他各组具有更强的抑制细胞迁移的能力，Transwell实验显示丹参酮IIA免疫纳米粒组较其他各组具有更强的抑制细胞侵袭能力(p <0.01)。丹参酮IIA免疫纳米粒能够下调GSK3 β、Axin、APC的蛋白表达，较其他各组有明显优势(p <0.01)；可降低Wnt1 mRNA的表达，并且效果优于其他各组(p＜0.01)。.结 论: 本研究采用乳化蒸发法建立了EpCAM修饰的丹参酮IIA免疫纳米粒，与丹参酮IIA相比，丹参酮IIA免疫纳米粒具有良好的肿瘤靶向作用，能有效提高丹参酮 IIA的细胞毒性，对裸鼠肝癌具有较好的治疗作用。其抗肝癌的作用机制可能与调控Wnt/β–catenin信号通路抑制肝癌干细胞的侵袭转移有关。