溶酶体膜蛋白LAMP3对肝癌转移的影响及其机制研究

Lysosomes could promote tumor invasion and metastasis, lysosomal hydrolases are involved in this mechanism, however the role of lysosomal-associated membrane proteins (LAMPs) is still in blur. In our previous study, we have found that lysosomal-associated membrane protein 3 (LAMP3) could promote liver cancer cell metastasis(in vitro and in vivo), regulate the F-actin dynamics and enhance the activity of Cdc42 after up-regulating the expression of LAMP3 in liver cancer cells. In this project we are trying to observe LAMP3 expression level and its role in the pathogenesis of liver cancer. That include: 1.The measure of LAMP3 expression level in liver cancer tissues by real-time PCR and IHC. 2 The investigation of LAMP3 functional effect on liver cancer metastasis in vitro and in vivo by gene expression regulation. 3. The role of Rho, Rac1, Cdc42 in this association mechanism. The finish of this project will suggest a potential targeting application of LAMP3 in prognosis and cancer treatment and shield a beacon light on our understanding of liver cancer metastasis.

肿瘤细胞溶酶体在肿瘤的侵袭转移中起着促进作用，但目前的相关机制研究，仍集中于溶酶体内蛋白酶对肿瘤侵袭转移的影响，而对溶酶体膜相关蛋白在肿瘤细胞侵袭转移中的作用及其分子机制，尚无明确阐述。我们的前期研究发现溶酶体膜相关蛋白LAMP3在肝癌细胞稳定过表达后，可促进肝癌细胞的转移，同时诱导细胞骨架F-actin重排并上调Cdc42活性，提示LAMP3可能是肝癌转移的促进因子。以此为基础，本课题将：①在临床样本中研究LAMP3在肝癌组织中的表达及相关临床意义；②通过基因过表达及RNA干扰技术，明确LAMP3对肝癌细胞转移及细胞骨架重排的影响；③重点研究LAMP3对调控细胞骨架重排的Rho蛋白家族Rho、Rac1及Cdc42等表达及活化水平的影响，并进行反证实验，明确LAMP3促进肝癌细胞转移的分子机制。本研究的完成，将进一步明确原发性肝癌转移的分子机制，为形成肝癌转移治疗新策略提供理论基础。

肿瘤细胞溶酶体在肿瘤的演进过程中起着不可忽视的作用，但其相关机制的阐述，仍显匮乏。本课题以溶酶体膜相关蛋白 LAMP3 为研究目标，初步揭示溶酶体在肿瘤的演进过程中扮演的角色。免疫组化检测结果提示， LAMP3在肝癌组织的平均表达水平要低于癌旁组织；在肝癌组织中，表达LAMP3的肝癌患者的生存期（37.599个月）要低于未表达LAMP3的肝癌患者（44.643个月），但两组未见明显统计学差异（P>0.05）。肝癌TCGA数据库分析结果显示，LAMP1、LAMP2在肝癌及其癌旁组织中的表达无明显差异（P>0.05），LAMP3在肝癌中表达高于其癌旁组织中的表达（P<0.05）；高表达LAMP3的肝癌患者的生存期（410个月）要明显少于低表达LAMP3的肝癌患者（899个月）（P=0.0378）。LAMP3在肝癌细胞中稳定过表达后，明显促进细胞增殖；细胞周期检测结果显示，LAMP3上调细胞S期比率。通过RNA干扰技术，将LAMP3下调后，细胞增殖被抑制；细胞G1期比率上升，S期比率下调。免疫印迹结果提示，LAMP3可以同时改变p21与p27蛋白的表达水平，并调控Akt的磷酸化水平。激光共聚焦显微镜检测结果提示，LAMP3可以显著抑制肿瘤细胞的自噬；免疫印迹结果证实，LAMP3抑制I 型微管相关蛋白轻链3向II 型微管相关蛋白轻链3的转化，并激活AMPK-mTOR信号通路。体外结果显示， LAMP3明显促进肝癌细胞的侵袭及迁移。对细胞骨架进行染色，通过激光共聚焦显微镜观察后发现，LAMP3明显诱导F-actin重排，对α-tubulin无显著影响。免疫印迹实验与Real-time PCR检测结果提示，LAMP3明显增强Cdc42及Rac1的磷酸化水平，提高Cdc42及Rac1的激酶活性；对Rho的磷酸化水平无显著影响，且LAMP3对 Cdc42、Rac1、Rho的表达无显著影响。