STUB1基因突变导致Gordon Holmes综合征的机制研究

Gordon Holmes syndrome is a rare hereditary neurological disorder with manifestations of progressive ataxia and hypogonadism. It often accompanies an autosomal recessive inheritance model and is also considered to be a special subtype of hereditary ataxia. Although this disorder had been recognized more than 100 years, until May in last year, its first and second disease-causing gene RNF216 and OTUD4 had just been identified. In our previous work, we found that STUB1 is the third disease-causing gene of Gordon Holmes syndrome. In this study, based on the new finding, we plan to establish the in vitro cell model, Knock-in transgenic mice model and patient-specific iPSC model and use the technology of Immunofluorescence, Western-blot, Co-IP, in vivo and vitro ubiquitin assay, high-throughput sequencing, and Zinc-finger nucleases based targeted gene modifying to further investigate the pathogenesis mechanism of how deficiency of E3 ubiquitin ligase CHIP caused by STUB1 mutation leads to Gordon Holmes syndrome. This study will also provide new methods and ideas for the research of hereditary ataxia.

Gordon Holmes综合征是遗传性共济失调类疾病的一种特殊亚型，临床表现为进行性共济失调合并性腺发育不全，其遗传方式为常染色体隐性遗传。尽管临床上对于此疾病的认识已有100年时间， 直到去年5月，其第一、二种致病基因RNF216和OTUD4才被鉴定克隆。我们在前期工作中发现：STUB1是Gordon Holmes综合征的第三种致病基因。本研究在前期工作基础上，拟进一步构建体外细胞模型、STUB1基因突变Knock-in小鼠模型、患者特异iPSC模型等三种新的Gordon Holmes综合征疾病模型，并采用免疫荧光、免疫印迹、免疫共沉淀、泛素化测定、高通量测序、锌指核酸酶靶基因定点修饰等技术其进一步深入探讨STUB1基因突变引起其编码蛋白泛素E3连接酶CHIP功能障碍导致Gordon Holmes综合征的分子病理机制，将为遗传性共济失调类疾病发生机制的相关研究提供新的方法与思路。

戈登-福尔摩斯综合征（Gordon Holmes Syndrome）是一种罕见的常染色体隐性遗传性神经变性病，临床上表现为青少年发病，主要症状有共济失调、性腺发育不良同时伴有认知障碍。本课题组在世界上首次报道了CHIP基因突变可以导致Gordon Holmes综合征，是该病的第三种致病基因。我们在前期的基础上深入研究了CHIP致病突变T246M发生后对CHIP结构、生物学功能的影响。结果显示T246M突变改变了CHIP的空间结构，突变体CHIP多以多聚体的形式存在；突变CHIP蛋白可溶性降低，其亚细胞定位并未发生改变。我们发现T246M突变型STUB1质粒转染细胞后对线粒体膜电位无明显影响；但突变STUB1使细胞凋亡水平明显升高。我们对携带STUB1基因T246M突变的Gordon Holmes综合征患者皮肤成纤维细胞进行体外重编程及鉴定，成功构建患者特异性携带STUB1 T246M突变的iPS细胞。与野生型iPS细胞相比，患者特异性携带STUB1 T246M突变的iPS细胞形态无明显改变。野生型及特异性携带STUB1 T246M突变的iPS细胞均可定向分化为神经干细胞，分化效率及形态基本一致。我们取STUB1基因T246M突变iPS细胞系及正常人来源的神经元，提取总RNA，进行转录组学研究，后利用生物信息学分析手段明确STUB1基因T246M突变iPS细胞系和正常人来源的iPS细胞系来源的神经元转录组水平的表达差异。结果显示表达下调的RNA 52种，表达上调的RNA 148种。我们应用CRISPR/cas9技术构建了CHIP T246M突变大小鼠两种动物模型，我们从生存期，体重，运动能力，认知能力等多个方面进行了研究，证实T246M大小鼠动物模型很好的模拟了Gordon Holmes综合征的临床表现，为后续研究提供了很好的模型。我们取大鼠小脑组织进行了蛋白组学研究，最终得到了80种表达上调，63种表达下调显著差异表达蛋白，并选取TAU、α-syn、PDE9A等差异表达蛋白进行了验证。以上结果为后续研究奠定了基础提供了思路。本项目的完成为揭示STUB1基因突变导致Gordon Holmes综合征的致病机制提供了可靠的实验证据。