组学技术研究枯草芽孢杆菌高效合成聚γ-谷氨酸的分子调控机制

Poly-γ-glutamic acid (PGA) is a biodegradable polymer with wide application in the field of food, medicine, cosmetics, agriculture and environmental protection etc, which produced mainly by Bacillus subtilis. Due to the lack of overall and rational understanding in the PGA synthesis and metabolic regulation mechanism, its fermentation level encounter bottleneck. In this study, the strain GXA-28 with capable of PGA production and strain 168 with incapable of PGA production were used as research materials. We try to compare the different of gene expression and total intracellular protein between GXA-28 and 168, and in the different fermentation stages of GXA-28, by RNA-Seq technology and two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry technology. Base on these studies, we try to obtain genes and proteins that taking part in PGA synthesis and molecular regulation, and speculate the possible biology functions of these genes and proteins, and then elucidate the molecular regulation mechanism of high efficient PGA production by Bacillus subtilis at the level of omics. These results have important significance on reveal the PGA synthesis and its regulation mechanism comprehensively.

聚γ-谷氨酸（PGA）主要是由枯草芽孢杆菌合成的一种可降解高分子聚合物，在食品、医药、农业、环保及化妆品领域具有广泛应用前景。本研究针对目前PGA合成及其调控机制缺乏全局性和机理性认识，严重制约其工业化生产这一关键问题，以课题组选育的Bacillus subtilis GXA-28（高产PGA）和模式菌B. subtilis 168（不能合成PGA）为研究对象，拟通过RNA-Seq技术和蛋白质二维电泳-质谱技术对两株菌的基因表达和胞内总蛋白差异进行横向比较、对GXA-28在不同发酵阶段的基因表达和胞内总蛋白差异进行纵向分析，通过整合横向和纵向数据，以期筛选获得参与PGA高效合成及其调控的基因和蛋白质并推测其可能的生物学功能，进而在组学水平上阐释枯草芽孢杆菌高效合成聚γ-谷氨酸的分子调控机制。研究结果对全面系统揭示PGA合成及其调控机制具有重要意义。

本项目以课题组选育的Bacillus subtilis GXA-28（高产PGA）和模式菌B. subtilis 168（不能合成PGA）为研究对象，通过基因组、转录组和蛋白质组的多组学整合技术从横向（GXA-28和168之间）和纵向（GXA-28不同发酵阶段）两个层面，筛选获得参与PGA高效合成及其调控的基因和蛋白质并推测其可能的生物学功能。首先依据PGA发酵液具有高粘度、菌体不易分离的特点，建立了缓冲液稀释离心法收集菌体细胞用于转录组学和蛋白质组学研究。通过B. subtilis GXA-28和B. subtilis 168横向对比分析，基因组水平上检测到变异基因1743个；转录组水平上检测到2085个差异表达基因；蛋白质组水平上检测到850个胞内差异表达蛋白。通过B. subtilis GXA-28不同发酵阶段纵向对比分析，发酵16h相对于发酵6h，检测到差异表达基因859个、差异蛋白264个；发酵24h相对于发酵6h，检测到差异表达基因743个、差异蛋白509个；发酵24h相对于发酵16h，检测到差异表达基因63个、差异蛋白228个。利用NR，SwissProt，GO，COG，KEGG等功能数据库对上述差异基因和蛋白进行了功能注释分析。通过文献调研和分析，B. subtilis GXA-28菌株中PGA合成主要涉及葡萄糖转运、铵离子转运、外源谷氨酸钠转运、α-酮戊二酸支路和内源性谷氨酸合成、PGA合成、PGA降解及调控等途径的基因及其编码蛋白38个，在基因组水平上这些基因和蛋白质有13个发生突变，在转录组和蛋白质组水平上这些基因和蛋白质也存在大量差异表达。本项目研究结果为后续深入研究PGA合成及其调控机制提供了大量的候选基因和蛋白质。