基于新一代测序的体液特异microRNAs法医学探索研究

Identifying the origin of body fluids left at a crime scene is significant to uncover the criminal nature of an event. Conventional serology- and immunology- based methods for body fluid identification are prone to various limitations, they are not suitable for the analysis of degraded and trace samples. The intrinsically short fragment (approximately 22 nt) and tissue-specific expression pattern enable microRNA as an ideal biomarker for body fluid identification. However, current technologies for screening differentially expressed microRNAs are obviously insufficient, and the number of microRNA markers is not enough for identification of forensically relevant body fluids. Next-generation sequencing technology highlights the study of body fluid specific microRNAs in forensic medicine. Based on the previous work experience, we intend to clarify the genome-wide expression patterns of microRNAs in human body fluids at nucleotide resolution using the Next-generation sequencing, which could provide theoretical basis and scientific evidence of the potential use for body fluid identification.

阐明遗留于犯罪现场的人类体液斑痕的组织来源对明确案件性质极为重要。传统的体液鉴定方法，包括血清学和免疫学方法，不适用于法医微量和降解检材。平均长度仅22个核苷酸的microRNAs具有独特优势，更适宜用于法医降解检材分析；其组织差异性表达特征为体液斑的组织来源鉴定带来了希望。然而目前筛选不同体液中差异表达的microRNAs的检测技术存在效能不足的问题，体液标记microRNAs数量有限，尚不能够有效地鉴别法医学常见体液。新一代测序技术，为体液标记microRNAs的法医学研究提供了新的前景。本课题拟在前期工作的基础上，利用新一代测序技术高通量并行测序的特点，在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化人类不同体液中microRNAs的表达情况，探索和寻找具有法医学鉴定意义的microRNAs，为进行不同体液斑鉴定奠定理论基础和提供科学依据。

阐明遗留于犯罪现场的生物检材的组织体液来源对案件性质的判定起着至关重要的作用。基于免疫学和血清学的传统体液鉴定方法并不适用于法医工作中常常遇到的降解和微量检材。平均长度仅22个核苷酸的microRNAs为法医体液斑鉴定带来新的契机。这类内源性非编码的小分子RNA具有长度短和组织体液差异性表达特征，作为组织体液鉴定的候选分子标记时具有独特优势。本研究在前期microRNA研究的基础上，利用新一代测序技术在全基因组范围内系统分析人类不同体液中microRNA的分布规律，进而筛选出体液标记microRNAs：1). 在Ion Torrent平台上探索建立了体液斑microRNAs测序的检测流程（从体液样本的RNA提取、小RNA文库构建和测序）和开发了基于Perl语言的测序分析插件miRDong；2). 利用建立的检测分析流程获得了血液、唾液、精液、阴道分泌液和月经血样本中microRNAs的表达分布，分析筛选出45个潜在的体液标记microRNAs和在上述5种体液中表达相近的（候选内参基因）7个microRNAs（miR-26b，miR-92，miR-93，miR-144，miR-191，miR-374a和miR-423）；3). 利用实时定量PCR技术验证筛选出的体液标记microRNAs（血液：miR-451a，miR-16，miR-486，miR-182；唾液：miR-223，miR-145，miR-203a；精液：miR-888，miR-891a，miR-2392；阴道分泌物：miR-200c，miR-1260b，miR-205和月经血：miR-214，miR-144，miR-205，miR-451a）并评估14个候选内参基因（7个microRNAs和RNU6B，RNU19，RNU24，RNU43，RNU48，RNU49，RNU66）在法医体液斑的表达稳定性；4). 在毛细管电泳平台上构建体液标记microRNAs的复合扩增体系。综上，本研究获得了法医学常见体液斑中的microRNAs表达模式，为利用microRNAs进行组织体液鉴定提供了基础数据；跨平台系统验证筛选出的体液标记microRNAs和常见内参基因，为microRNAs体液鉴定提供理论依据；在毛细管电泳平台上尝试复合检测体液标记microRNAs，为法医microRNAs体液鉴定提供通用的检测体系。