呋喃虫酰肼抗性小菜蛾中EcR/USP基因表达及功能分析

双酰肼类杀虫剂是当前害虫防治中替代高毒有机磷药剂的优选药剂。但抗药性问题也日益严重。害虫产生抗药性是其对杀虫剂适应的一种普遍策略，明确害虫抗药性的分子机理是解决害虫抗药性问题的关键。该项目以重要蔬菜害虫小菜蛾为对象，（1）克隆小菜蛾中呋喃虫酰肼的主要靶标－蜕皮激素受体（EcR）和超螺旋蛋白（USP）不同异构体的基因并对呋喃虫酰肼抗性及敏感小菜蛾的序列比较分析；（2）比较抗性和敏感小菜蛾品系EcR和USP不同异构体mRNA的表达水平，测定呋喃虫酰肼短期诱导对EcR和USP不同异构体表达丰度的影响；（3）应用RNAi技术研究明确EcR和USP的不同异构体在小菜蛾对呋喃虫酰肼抗性中的功能。通过上述研究，最终阐明小菜蛾对呋喃虫酰肼产生抗性的分子机理，以期为完善害虫对双酰肼类杀虫药剂的抗性机制理论提供依据。该研究对于有效治理田间抗性小菜蛾、延长双酰肼类杀虫药剂的使用寿命也具有重要的实践价值。

本研究在室内筛选获得小菜蛾呋喃虫酰肼高抗品系（320倍）的基础上，系统研究了小菜蛾对呋喃虫酰肼抗性的稳定性和生化机制，克隆获得了双酰肼类杀虫药剂的靶标――蜕皮激素受体复合体（EcR/USP）三个亚基的基因全长，研究了其时序表达谱，并通过体外表达和配体结合实验，对不同亚基的功能进行了研究。发表SCI论文5篇，核心期刊论文4篇，培养毕业博士生1人。顺利完成了项目计划任务。.结果表明，小菜蛾对呋喃虫酰肼的抗性不稳定，且抗性的产生是以降低生物适合度为代价的，随抗性衰退，其生物适合度逐渐恢复。交互抗性谱显示当小菜蛾对呋喃虫酰肼的抗性衰退后，对虫酰肼、甲氧虫酰肼、抑食肼、氟铃脲和阿维菌素的交互抗性也明显下降，表明小菜蛾对上述药剂的抗性可能存在相同的抗性机制。解毒酶测定显示当小菜蛾对呋喃虫酰肼的抗性水平下降时，MFO、GSTs、酯酶和芳基酰胺酶活性也随之下降，表明小菜蛾对呋喃虫酰肼的抗性与上述四种酶活性增强有关，另外这四种解毒酶活性增强很可能是导致小菜蛾对前述6种杀虫剂产生交互抗性的主要原因。.小菜蛾存在PxEcRA和PxEcRB及一个USP异构体（PxUSP）。PxEcRA和PxEcRB的区别仅在可变的N端A/B区，且每个异构体还有两种不同的剪切变体（剪切变体的区别主要是D区5个氨基酸LDCLQ的存在与否）。定量PCR检测显示PxEcRB表达量在整个幼虫期均高于PxEcRA，但不同发育阶段PxEcRA与PxEcRB的表达谱类似；PxUSP表达量在整个发育期变化不大。在预蛹期、蛹期及成虫期，抗性品系PxEcRA表达量高于敏感品系，而幼虫期两品系表达量无差异；PxEcRB表达量在整个发育期均是敏感品系高于抗性品系；两品系PxUSP表达量不存在差异。配基结合实验显示 [3H] Ponasterone A不与单体PxEcRA及PxUSP结合，也不与PxEcRA/USP复合体结合，但能与单体PxEcRB结合，且在PxUSP存在的情况下，其结合能力更强，受体复合体Kd为3.01.7 nM。根据上述结果及抗性品系成虫的生殖力显著低于敏感品系和衰退品系，推测PxEcRA可能跟生殖相关，而PxEcRB/USP复合体则可能是双酰肼类药剂的作用靶标，具有真正的毒理学意义。