茚虫威抗性小菜蛾ABCC2蛋白基因功能分析

This research owing to the latest research for the multi-drug resistant related ABCC2 protein from medical field, and based on the precious National Natural Science Foundation (30971936), we use indoxacarb resistant selection strain (RR455) as materials to indentify the function of ABCC2 protein of indoxacarb resistant diamondback moth by molecular biology, proteomics and related technologies. We first clone the full length of ABCC2 gene from susceptible and resistant strain of diamondback moth, and compare the difference between the nucleotide and amino acid;Then useQ-PCR to analysis the difference of mRNA expression level of ABCC2 gene from different instars and between susceptible and resistant strain; after that the ABCC2 gene were expressed in insect cell Sf9 and purification, and on the same time we separate and purify the ABCC2 gene from susceptible and resistant strain; and recombine the purified ABCC2 gene and protein phospholipid, to study the change of affinity between the ABCC2 protein and indoxacarb from susceptible and resistant strain of diamondback moth. Our study could explicit the relationship with the amino acid mutations of ABCC2 protein or the expression level difference involved in indoxacarb resistance. The results could clarify the indoxacarb resistance mechanisms and provide the basis for research and development of molecular design for resistant reversal agent.

本研究拟在前一个国家自科基金（30971936，已提交结题报告）基础上，以本实验室汰选培养的茚虫威抗性品系（RR455）为供试材料，借鉴医学领域有关多药抗药相关蛋白ABCC2研究的最新进展，采用分子生物学和蛋白组学相关技术对茚虫威抗性小菜蛾ABCC2蛋白进行功能分析。首先克隆抗敏品系小菜蛾编码ABCC2的基因全长，比对其核苷酸和氨基酸差异，采用实时荧光定量PCR技术研究ABCC2基因在不同龄期和茚虫威抗敏品系小菜蛾中表达量的差异；而后将抗敏品系ABCC2基因分别在昆虫细胞Sf9中表达后分离提纯，同时直接从抗敏品系中分离纯化ABCC2蛋白；将纯化的ABCC2与蛋白磷脂体重组，研究抗敏品系小菜蛾ABCC2蛋白与茚虫威的亲和性力变化。旨在明确小菜蛾ABCC2蛋白氨基酸突变或者表达量的差异与抗茚虫威的关系。研究结果一方面可阐明小菜蛾对茚虫威的抗性机制，另一方面为研究开发抗性逆转剂分子设计提供依据。

害虫抗药性问题是世界性难题，小菜蛾是抗性害虫的典型代表，从根本上弄清抗性产生的机制是有效地治理小菜蛾的关键。本研究借鉴医学领域有关多药抗药相关蛋白ABCC2 的研究成果，采用分子生物学技术克隆了小菜蛾茚虫威敏感品系和抗性品系的abcc2基因，发现小菜蛾abcc2编码区有4044个碱基，编码1347个氨基酸，含有两个保守的跨膜结构域和两个ATP结合结构域，具有典型ABC转运蛋白特征。分析这两个品系中ABCC2氨基酸序列差异，发现位于保守域上的T483S、D979G和H1255N突变可能对小菜蛾的茚虫威抗性有关。荧光定量分析发现小菜蛾抗性品系abcc2基因表达量是敏感品系的6.7倍，且不同农药处理后，均可以显著提高ABCC2 mRNA的水平；时空表达分析发现ABCC2在小菜蛾幼虫和成虫期表达量较高，在蛹期和卵中表达量很低，取4龄幼虫解剖发现，中肠中ABCC2表达量显著高于其它组织，这些均表明ABCC2在物质跨膜运输中发挥重要功能。本研究构建了HEK-293/ABCC2稳转细胞系，比较稳转细胞和对照细胞对药剂的敏感性差异，发现HEK-293/ABCC2细胞对阿维菌素和溴虫腈的敏感性显著低于对照细胞，同时利用棉铃虫胚胎细胞进行抑制剂处理，发现丙磺舒处理后细胞对阿维菌素的敏感性显著提高，另外分离棉铃虫中肠组织检测不同处理下阿维菌素的峰值浓度，发现联用丙磺舒处理后细胞中阿维菌素峰值含量显著上升，是未用抑制剂处理的2.8倍，这些研究表明ABCC2蛋白参与阿维菌素的转运。但通过RNA干扰抑制小菜蛾ABCC2的表达和用丙磺舒处理小菜蛾抑制ABCC2蛋白功能，均没有发现小菜蛾对阿维菌素的抗药性发生显著改变。推测ABCC2并不是小菜蛾产生抗药性的决定性因素，ABCC2是否通过间接途径影响小菜蛾抗药性还需要进一步的研究。最后对小菜蛾ABCC2蛋白进行昆虫细胞异源表达和纯化，借助Bac-to-Bac表达系统，通过膜蛋白提取试剂提取和His亲和纯化，对ABCC2进行了有效纯化，为深入研究其功能奠定了基础。