抗菌磷酸钙微囊化可调控表达系统导入BMP基因细胞修复骨缺损的实验研究

Our researches have shown that calcium phosphate cement(CPC) has biocompatibility, biodegradation and little osseo-induction performances , CPC With Recombinant human bone morphogenetic protein2(rhBMP2) can induce more formation of new bone. but there are some problems which haven't been solved yet such as the ossification was not synchronous with the material degradation, immunological rejection and the risk of infection. Therefore, how to solve these problems become new aims for our further researches. we have successfully constructed an effective TetOn expression system for transferring hBMP-2 gene into bone marrow mesenchymal progenitor cells (BMSCs) and then Microencapsulated it. Higher expression of BMP protein have detected by low dose Doxycycline (DOX ) induction. Some animal experiment researches have confirmed that the composite of VCM-CPC have a good antibacterial capability.We combine biodegradable CPC with antibiotics modification,generegulation,and microcapsule,to develop a new artificial compound- bone. We expect to obtain a novel bone-repairing material which can provide a good bone-repairing effection in vivo through DOX induction in vitro.

我们已经证实磷酸钙骨水泥（CPC）是一种可降解、生物相容性高的骨替代材料，可引导新骨形成,但新骨形成少且慢；复合rhBMP-2的CPC材料新生骨形成多而早；但存在的缺点为：成骨速度与材料降解速度不同步，且植入体内面临免疫排斥及感染风险，如何解决以上问题成为我们下一步研究的重点。我们已经证明在体外利用腺病毒作为载体构建的TetOn调控系统共转染骨髓间充质干细胞微囊化后BMP基因可在强力霉素（DOX）诱导下高效定量表达，且能降低免疫原性。通过表面修饰技术构建的万古霉素-CPC复合体已在动物实验中证实具有良好的抗菌效果。本项目拟进一步将可生物降解磷酸钙骨替代材料、抗生素表面修饰、基因调控和免疫隔离微囊这四项技术有机结合起来，形成新型复合骨替代材料。将其植入骨缺损部，通过体外调控，获得最佳的骨修复效果，旨在为骨缺损的修复提供新方法、新材料。

感染性大段骨缺损需要植骨修复，自体骨数量有限，异体骨易排斥，普通的人工骨材料缺乏成骨和抗感染能力。我们的前期研究构建了腺病毒为载体的BMP2/Tet-on调控骨髓基质干细胞（BMSCs）表达BMP2，但转染效率不高。本研究构建了BMP-2/Tet-on双系统的慢病毒载体，并转染大鼠BMSCs，成功在DOX诱导下表达BMP2；且BMSCs的生长、增殖、分化均不受影响(p>0.05)；制备了直径在80-160μm的新高分子材料含酚基羧甲基纤维素（CMC-Ph）微囊细胞系统，该微囊在力学性能、均匀度、细胞存活率方面均优于海藻酸钠微囊（p<0.05）；转染BMP-2/Tet-on后的BMSCs在可经DOX调控分泌BMP2至囊外，且破囊后细胞增殖和成骨分化能力无改变（p>0.05）。为构建有抗感染作用的CPC支架，筛选不同造孔剂质量分数制备大孔CPC支架，其抗压强度、刚度、弹性模量、孔隙率和大孔率随造孔剂质量分数不同而不同（P＜0.05）；最终选择孔隙率30%的CPC支架，电镜检测其孔径大小约为1mm。含万古霉素的壳聚糖微球载药率为13.6%，药物包封率30.6%；体外缓释实验中，经过10天的释放，其浓度仍未下降。载药微球与大孔CPC复合，根据力学强度和药物缓释率，6mg微球含量和30%孔隙率为适宜支架，体外药物可持续释放10天以上。本研究采用3D打印孔径均一的CPC支架与成骨活性的微囊细胞系统复合，修复兔桡骨缺损12周时显示有明显骨痂生成，优于无BMP2活性的CPC支架，获得了良好的成骨修复效果。下一步还需组合CPC药物缓释抗感染功能进一步为感染性骨缺损修复提供新的思路和材料。