超声微泡促进BMP-2基因体内转染和表达治疗骨缺损的实验研究

骨缺损、骨不连接仍是骨科领域的治疗难题，研究表明骨形成蛋白（BMP）等诱导因子的缺少是骨不愈合的重要因素，增加这些因子可促进骨愈合。体外实验证明转染hBMP-2基因可促进成纤维细胞等分泌BMP并促进此类细胞向成骨细胞转化，而这些细胞是骨创伤后愈合早期肉芽组织的重要组成。结合前期的实验，我们推测利用近年发展迅速的超声微泡破碎技术可能促进BMP-2基因在骨创伤后肉芽组织细胞内的转染和表达，促进相关细胞向成骨细胞转化而达到治疗骨缺损/不连接之目的。本课题拟通过建立大白兔前肢桡骨骨缺损模型，在肉芽形成早期注射携pEGFP-hBMP-2基因的超声微泡，采用不同参数对骨缺损部位进行超声辐照，应用超声造影、组织细胞学、免疫组织化学和电镜、X线照片等方法，观察BMP-2、pEGFP基因在骨缺损部位的转染和表达、细胞的转化和骨形成情况。旨在为探索一种基因治疗骨不愈合的新方法提供理论与实验依据。

课题获得立项后，项目组依题开展了研究，首先建立大白兔前肢尺骨骨缺损模型，通过探讨各种对早期肉芽注射超声微泡的方法，并探索了不同参数下超声辐射对基因转染的影响，最后在优化参数下对注射携pEGFP、hBMP-2基因的超声微泡的肉芽组织进行超声辐照，应用超声造影、组织细胞学、免疫组织化学和电镜、X线照片等方法，观察了BMP-2、pEGFP基因在骨缺损部位的转染和表达、细胞的转化和骨形成情况。结果发现：1.兔桡骨中段缺损15mm制作骨缺损模型是切实可行的，超声微泡造影剂在骨折端局部肉芽形成及细胞活跃增殖有较强的灌注强度和较长的通过时间，但向骨缺损部位直接注射质粒微泡混悬液较静脉注射能获得更好地转染效果；2.超声微泡破碎技术可成功促进目的基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因、hBMP-2基因在兔骨缺损部位转染及表达，表达目的基因的细胞类型主要包括骨骼肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、神经细胞等；3.对兔骨缺损造模处行超声微泡破碎转基因技术时，最佳超声辐照强度是0.5 W/cm2，最佳超声辐照时间是2min；4.BMP2质粒在骨缺损处局部组织中成功转染和表达，且质粒转染表达的BMP2可以激发促进骨缺损处组织中BMP2的表达和分泌，进而促进具有分化潜能的细胞向成骨细胞分化，增加骨钙素分泌，并促进骨缺损的修复。