肿瘤抑制因子CYLD调节纹状体PI3K/Akt信号途径的研究

CYLD是一种去泛素酶和肿瘤抑制因子，在生命活动尤其是炎症和癌症中担当广泛而重要的作用，神经系统中的功能尚待研究。它在小鼠纹状体高度表达，作用却不明。我们前期工作发现PI3K/Akt信号途径调控神经元结构和功能，推测CYLD抑制纹状体PI3K/Akt途径。本项目用CYLD基因敲除小鼠和野生型小鼠为材料，通过RT-PCR、蛋白免疫印迹分析、免疫组织化学、磷酸钙转染、激光共聚焦显微成像和膜片钳技术等，从组织、细胞和分子水平探讨CYLD调节纹状体PI3K/Akt途径的机制。研究敲除CYLD基因后1.是否改变PI3K和Akt mRNA和蛋白质的表达；2.是否导致纹状体生长发育异常，PI3K/Akt途径是否参与调节；3.是否导致纹状体神经元突触大小、形态改变及PI3K/Akt途径的调节；4.是否导致纹状体神经元功能异常及PI3K/Akt途径的调节，以阐明PI3K/Akt途径和CYLD在纹状体的作用。

肿瘤抑制因子Cyld是一种去泛素化酶，在生命活动尤其是肿瘤的抑制、免疫、炎症反应等生理过程中发挥着广泛而重要的作用。它能识别并解除赖氨酸63位的多聚泛素链，影响蛋白之间的相互作用和细胞信号识别，参与信号通路。Cyld蛋白在小鼠中枢神经系统的纹状体中表达量最高，但其在神经系统尤其是纹状体中如何发挥作用，并未见报道。纹状体是最主要的皮层-基底神经节回路的输入核团，多为中型多棘神经元，90%以上的都是GABA能神经元，其膜电位偏好在两个的阈下水平——去极化的膜电位（up state，反映了神经网络激活时的突触整合）和超极化的膜电位（down state）之间振荡，神经元在这两种状态之间的转换是纹状体进行信息处理的基本特征。研究Cyld对纹状体Akt等信号通路、神经元up /down state的影响，对揭示Cyld在纹状体以及神经系统中的作用有重要意义。主要结果如下：.1. 通过免疫蛋白印迹(Western Blot)和免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)的方法，对野生型小鼠WT和基因敲除型小鼠Cyld-/-纹状体做组织提取、蛋白定量检测和组织切片染色，发现在基因敲除型小鼠Cyld-/-中，Akt的表达量没有显著性的变化，但是发挥功能的pAkt表达量显著性增多，说明敲除Cyld基因通过升高pAkt表达从而参与到pAkt调控的信号通路中来。.2. 采用在体细胞内及细胞外记录技术，比较Cyld基因敲除小鼠与同窝出生的野生型小鼠纹状体神经元以及皮层纹状体环路up/down state振荡活动的差别，推测Cyld基因缺失对GABA能受体功能的影响；并通过施加GABAB受体的激动剂和拮抗剂，探索GABAB受体在其中所起的作用。在Cyld基因敲除小鼠中，纹状体神经元自发放电时程降低，其慢波振荡活动的up states时程减小。没有发现Cyld基因敲除小鼠中初级躯体感觉皮层的自发放电节律性或慢波振荡up state的改变。.3. 纹状体神经元膜电位标准差以及动作电位发放速率的结果表明Cyld基因缺失显著改变了膜电位的波动性、动力学特性和动作电位的发放时序，暗示着GABAA受体的功能发生了改变。.4. 证明敲除Cyld基因导致纹状体神经网络异常是通过影响纹状体GABAA和GABAB受体功能，而不是调控皮层向纹状体的输入。