水稻白叶枯病菌中依赖于TAT系统转运的外泌蛋白的鉴定及致病功能分析

病原细菌的双精氨酸转运系统（TAT）参与了病菌的致病过程，并且该系统对病菌致病过程的影响主要是依赖于该系统转运的外泌蛋白来完成的。申请者在前期工作中首次从水稻白叶枯病菌（Xoo）中鉴定了TAT系统，并证实TAT系统的破坏将严重降低Xoo对水稻的致病性（Chen et al., 2009）。本项目拟利用蛋白质双向电泳和质谱技术对Xoo野生型菌株和tat突变株的培养上清进行分析，鉴定出该菌中依赖于TAT系统转运的外泌蛋白；利用生物信息学、分子生物学、免疫学等技术，进一步从鉴定的外泌蛋白中筛选出1-2个致病相关蛋白，并探索这些蛋白的致病功能。研究成果对深入认识水稻白叶枯病菌的致病机制，寻找新的药剂靶标，设计白叶枯病控制策略具有一定的理论和实践价值。

水稻白叶枯病菌（Xoo）引起水稻白叶枯病，是影响亚洲水稻产量的一种严重细菌病害。TAT系统主要转运折叠蛋白，这类蛋白N末端信号序列包含有一保守的S/L-R-R-X-F-L-K 结构元件。本项目研究中（一）通过构建TAT系统关键基因tatC的缺失突变体，使TAT系统丧失转运蛋白的能力。之后，分别提取Xoo野生型PXO99A和tatC缺失突变体的胞外蛋白，通过蛋白质双向电泳技术研究二者的差异表达蛋白，共获得47个依赖于TAT系统转运的蛋白（TAT-dependent proteins)，并通过质谱从中鉴定了12个；（二）通过生物信息学的方法，在Xoo 菲律宾小种PXO99A基因组中比对，将N末端信号序列包含保守的结构元件S/L-R-R-X-F-L-K 的蛋白定义为TAT系统底物蛋白（TAT substrates），总共获得了21个TAT底物蛋白。接下来，分别从TAT-dependent proteins和TAT substrates中选取8个和6个目标蛋白/基因进行突变，共获得14个突变株。致病性结果显示，7个基因（1 TAT substrate和6 TAT-dependent proteins）参与Xoo在寄主水稻上的致病过程，它们的产物为TonB-dependent receptor, an Hcp family protein, OmpA family outer membrane protein, a hydrolase, peptidase, a tetratricopeptide repeat domain protein and adhesion-like protein。上述结果显示，多数致病因子的外泌受TAT系统调控，而不是真正的TAT系统底物蛋白。之后，本研究系统评价了2个致病相关基因（hcp和xadA）的工作机制，表明致病相关基因hcp和xadA主要是通过影响Xoo的抗氧化压力和寄主表面粘附能力参与调控致病性。本研究成果对深入认识TAT系统调控Xoo致病分子机制，寻找新的药剂靶标，设计白叶枯病控制策略具有一定的理论和实践价值。项目执行期内，发表研究论文6篇，其中SCI论文5篇，核心期刊1篇；培养研究生4名，其中博士研究生1名。本研究完成了项目规定的考核指标。