猪肠外致病性大肠杆菌Tat系统的底物蛋白鉴定及其调控致病性的机制研究

Extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC）is an important zoonotic pathogen. The isolation rate of ExPEC from pigs is increasing， and the isolated strains are highly virulent and contain complex virulence factors, which poses a huge threat to pig industry and public health. Therefore, it is of great significance to study the pathogenesis of porcine ExPEC. The Tat system is an important bacterial protein transport system, which is able to export a variety of substrate proteins across the cell membrane and regulate the pathogenicity of bacterial pathogens. However, the underlying mechanism remains to be investigated. The applicant’s previous studies have elucidated the working mechanism of the Tat system in model Escherichia coli and established a method fors Tat substrate proteins identification. Based on these studies, the current project will firstly investigate the role of the Tat system in the pathogenesis of a porcine ExPEC strain isolated by our lab. By using a comparative proteomic approach and a previously established protein translocation reporter system, the Tat substrate proteins of the ExPEC will be identified. Then, the effect of important Tat substrate proteins on the virulence of ExPEC will be confirmed by using gene deletion, genetic complementation as well as an animal infection model. This study aims to uncover the role of the Tat system in ExPEC pathogenesis, which will contribute to identifying novel drug targets against ExPEC and elucidating the mechanism of its pathogenesis.

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一种重要的人兽共患病原菌，近年来在猪群中的分离率呈上升趋势，分离株致病性强、毒力因子复杂，对养殖业和公共卫生造成重大威胁，研究猪ExPEC致病性及其调控机制具有重要意义。Tat系统是细菌的一种重要蛋白转运系统，能够跨膜转运多种底物蛋白，调控细菌的致病性，但其调控机制尚不明确。申请人前期解析了模式大肠杆菌Tat系统的转运机制，建立了Tat系统底物蛋白鉴定方法。本研究拟在此基础之上，以实验室前期分离的猪源ExPEC为研究对象，研究Tat系统对ExPEC致病性的调控作用，利用比较蛋白质组技术和前期建立的蛋白转运报告系统鉴定Tat系统底物蛋白，并通过基因缺失、遗传互补及动物试验确定重要Tat系统底物蛋白对ExPEC致病性的影响，最终阐明Tat系统调控ExPEC致病性的分子机制，为发现新的抗ExPEC药物靶标及阐明ExPEC的致病机理提供理论基础。

肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是一种重要的人兽共患病原菌，近年来ExPEC在我国猪群中逐渐流行，对养殖业和公共卫生构成严重威胁。目前，猪ExPEC的发病机制尚不清楚，缺乏针对该病的有效防治手段。因此，挖掘猪ExPEC的毒力因子，深入开展致病机制研究对新型疫苗和药物研发具有重要意义。Tat系统是细菌的一种重要蛋白转运系统，调控多种病原菌毒力，但其调控机制尚不明确。本研究构建了猪ExPEC强毒株PCN033的Tat系统基因缺失菌株及其互补菌株，通过动物感染实验证实Tat系统缺失导致ExPEC毒力显著下降，表现在半数致死量显著升高，在小鼠体内的定植能力显著下降。体外实验结果也表明缺失菌株的细胞黏附能力、抗巨噬细胞吞噬能力以及血清存活能力均显著下降，表明Tat系统对猪ExPEC致病力至关重要。利用蛋白质组技术结合生物信息学分析，在ExPEC PCN033菌株的基因组中鉴定了25个Tat底物蛋白。针对这些底物蛋白，逐一构建了基因缺失菌株。通过小鼠竞争性感染试验成功鉴定了与毒力相关的6个Tat底物蛋白，包括SufI、AmiA、AmiC、CueO、YahJ以及NapG，其中SufI、AmiA、AmiC对毒力影响最为显著。进一步研究发现Tat系统以及其毒力相关底物蛋白可能是通过影响细菌的细胞分裂以及通过影响细胞外膜完整性和运动能力调控ExPEC的应激响应能力及体内定植能力从而调控毒力。因此，本研究揭示了Tat系统在猪ExPEC致病过程中的作用，鉴定了强毒菌株中Tat系统的底物蛋白，初步阐明了Tat系统及其关键底物蛋白调控ExPEC毒力的机制。本研究为揭示猪ExPEC致病机制以及开发相应的防控产品奠定了理论基础。