控制胚胎干细胞分化关键基因的筛选和鉴定

胚胎干细胞（ES细胞）的分化及自我更新的分子机制是现代分子生物学和医学关注的重要研究领域，而发现新的参与和控制这一过程的基因是推动该领域研究的重要动力。在后基因组时代，一些新的、覆盖整个基因组的方法和技术为我们提供了有力的研究工具。本研究拟利用我们在以前的工作中建立的小鼠ES 细胞基因纯合子突变体文库进行大规模的筛选，期待发现控制ES细胞分化的多种基因，进而深入的理解这一重要的生命现象的机理，为未来合理安全的利用干细胞提供理论基础。

胚胎干细胞（ES细胞）的分化及自我更新的分子机制是现代分子生物学和医学关注的重要研究领域，而发现新的参与和控制这一过程的基因是推动该领域研究的重要动力。本研究拟利用我们在以前的工作中建立的小鼠ES 细胞基因纯合子突变体文库进行大规模的筛选，期待发现控制ES细胞分化的多种基因，进而深入的理解这一重要的生命现象的机理，为未来合理安全的利用干细胞提供理论基础。. 基本按计划进行，重新构建了piggyBac转座子介导的基因捕获突变载体，用该载体构建的突变文库会有效提高其基因组覆盖率，也就增加了筛选到“参与或控制ES细胞分化的基因”的概率。利用上述的HY18基因捕获突变载体，转染已有的“具有分化/未分化的可筛选性”的ES细胞株，获得约2万个独立的细胞克隆。选取包含约2千个细胞克隆的突变体文库，在诱导分化的条件下，经过两轮筛选后最终获得多个不易分化的突变克隆，经突变基因定位后发现包括Tcf3基因在内的多个候选基因。另外，我们还建立了一种能选择性分离基因纯合突变的胚胎干细胞克隆的通用方法。首先构建了一种基于piggyBac 转座子并包含两种筛选基因的突变载体并用它转染胚胎干细胞；得到的杂合子突变细胞克隆在增殖过程中可以自发产生少量纯合突变体；然后在细胞中导入Cre重组酶，作用于细胞中loxP序列后，只有纯合突变的ESC可以在包含两种药物的培养基中存活。由此，我们将极少的纯合突变体分选出来。目前已经获得几百种基因的纯合突变的ESC克隆，并分析了其中部分基因的功能。相关论文发表在Nucleic Acids Research, PLoS One 杂志上。. 我们还注意到国际上在单倍体胚胎干细胞（Haploid ESC）方面的最新进展，基于Haploid ESC构建突变体文库将会更简便高效，筛选工作也会更有效。所以及时开展相关工作，引进该细胞系，成功培养稳定传代，并利用它开展了新的“ESC基因纯合突变的文库”建立工作，并拟利用该文库进行“ESC 分化相关基因”的遗传筛选工作。