山葡萄抗寒信号转导MAPKK基因的克隆及功能分析

The high quality cultivated varieties from Vitis vinifera are susceptible to cold stress.So it is important for studying and using the cold resistance gene to expand the cultural area and improve the quality. MAPK cascade pathway plays an extremely important role in plant biotic and cold stress response, which transmits intracellular and extracellular signals to the cell response. This is the first study on the structure and function of MAPKK gene family of Vitis amurensis with high cold-resistant Vitis amurensis variety Zhuoshan-1 as the experiment material and the cold-susceptible Vitis vinifera variety Pinot Noir as the control material. The main research contents: the cloning of the MAPKK gene family member and its promoter sequence of Vitis amurensis; expression pattern of MAPKK gene of Vitis amurensis under cold stress to identify the key MAPKK related to cold resistance; the determination of subcellular localization of MAPKK gene; the function study of the key MAPKK gene and its promoter of Vitis amurensis; expecially the regulation to the cold-resistant function of MAPKK gene. This study will determine the function and mechanism of MAPKK gene of Vitis amurensis in cold signal transduction, which will provide gene resource for grapevine cold resistance breeding, and provide theoretical basis for the regulatory function of MAPKK.

优质欧洲葡萄品种不抗寒，因此，研究和利用抗寒基因是扩大葡萄栽培范围，提高品质的重要科学问题。MAPK级联途径是一类传递胞外和胞内信号到细胞响应的重要蛋白激酶，其在植物的生物和抗寒胁迫响应中发挥着极为重要的作用。本研究以高度抗寒的野生山葡萄左山-1为材料，以不抗寒的欧洲葡萄品种黑比诺为对照，首次研究野生山葡萄促分裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）基因家族成员的结构与功能。主要研究内容：克隆野生山葡萄MAPKK基因家族所有成员及其启动子序列；研究MAPKK基因在低温胁迫下的表达模式从而鉴定抗寒关键MAPKK基因；确定山葡萄MAPKK基因的亚细胞定位；进一步研究山葡萄抗寒关键MAPKK基因及其启动子的功能；特别是其对抗寒功能的调控；通过研究明确野生山葡萄MAPKK基因在抗寒信号转导过程中的作用和机理，为利用山葡萄进行抗寒育种提供基因资源，为山葡萄MAPKK基因的调控功能的利用提供依据。

按照申请书要求，完成了中国野生山葡萄MAPKK基因的克隆，低温条件下的表达分析，亚细胞定位、体外表达，启动子的克隆及功能分析，获得MAPKK基因转基因植株，以及MAPKK基因调控下的VvNAC94基因的功能研究，基本上达到申请书的要求。不足之处在于，此项目仅有一年的时间（2014.1-2014.12），对于转基因植株的抗寒性分析还未做，现已获得T0代植株，我们将继续补充完善。.MAPKK（促分裂原活化蛋白激酶激酶）是一类传递胞外和胞内信号到细胞响应的重要蛋白激酶，其在植物的生物和非生物胁迫响应中发挥着极为重要的作用。本研究以高度抗寒的野生山葡萄左山-1为材料，首次研究野生山葡萄MAPKK基因家族成员的结构与功能。主要结果研究如下：.1、克隆到山葡萄4个MAPKK基因，即VaMKK2、VaMKK4、VaMKK5和VaMKK6，分属于MAPKK基因的A，B，C三个亚家族。.2、定量分析了4个MAPKK基因在低温下的表达，VaMKK5和VaMKK6响应最强烈。.3、亚细胞分析表明，VaMKK4属于核蛋白，VaMKK2属于细胞质或细胞膜蛋白。.4、VaMKK5和VaMKK6原核表达优化条件：温度30℃，诱导浓度1mM。.5、获得VaMKK5和VaMKK6基因的启动子，瞬时表达表明此二启动子响应低温且有核心元件。.6、获得VaMKK2、VaMKK4和VaMKK6转基因烟草株系，待进行功能分析。.7、葡萄叶片瞬时转染分析，VaMKK6调控下游VvNAC94基因的表达。.8、VvNAC94属于核蛋白，且响应干旱、低温的诱导。.9、VvNAC94基因引起转基因烟草叶片卷曲，延缓叶片的衰老。.10、VvNAC94基因负向调控对干旱的抗性，但是却增强了对ABA的敏感性且提高了对低温的抗性。