中国野生山葡萄抗寒转录因子的克隆与功能研究

冻害是严重危害葡萄生产的逆境因素之一，它不仅限制了葡萄的栽培范围，而且也造成葡萄产量、品质的降低。培育抗寒葡萄品种成为当前世界葡萄育种中的一个重要方向。本项目是基于目前模式植物拟南芥抗寒代谢理论研究基础，针对品质优良的欧洲酿酒葡萄抗寒力差的缺陷，利用抗寒葡萄种质中国野生山葡萄中的抗寒转录因子基因资源，采用分子生物学方法重点研究 (1) 山葡萄抗寒转录因子的结构与功能；(2) 山葡萄抗寒转录因子基因上游调控序列的表达调控特性；(3) 进一步将从山葡萄中获得的抗寒转录因子用于改良欧洲酿酒葡萄品种赤霞珠的抗寒性，从而获得不需埋土防寒即可安全越冬的葡萄新品系。本项目旨在揭示山葡萄抗寒转录因子在抗寒代谢途径中的调控作用，项目的研究成果对于解决制约我国葡萄产业特别是宁夏葡萄生产中存在的冻害问题具有现实意义，并可为利用山葡萄抗寒转录因子基因资源进行植物抗寒育种提供深层次的理论依据。

本课题针对中国野生山葡萄抗寒分子ICE-CBF-COR代谢途径中的核心调控转录因子进行抗寒分子研究，按照原定计划完成了山葡萄转录因子基因ICE的克隆、鉴定及功能研究，分离了其上游调控序列并进行了低温胁迫下的活性分析；进一步开展了ICE基因转化葡萄的研究。本项目所克隆的山葡萄ICE基因家族两个成员VaICE1&VaICE2，均为MYC-型 bHLH转录因子，具有转录激活活性，定位于细胞核，两者由于结构上的差异导致其对低温胁迫响应的表达模式的不同；从生理生化与分子层面解析了两个转录因子过量表达增强抗寒性的原因，转化植株叶片组织中脯氨酸含量在低温胁迫下显著高于野生型，丙二醛含量显著降低、电渗率显著降低；同时，抗寒代谢途径下游基因CBF1, COR15A, COR47，KIN1受低温诱导表达量显著高于野生型植株。基于在模式植物中的功能验证，进一步进行了欧洲葡萄霞多丽的遗传转化，获得经PCR、Southern blot检测的VaICE1阳性植株17株，VaICE2阳性植株7株，转化植株生长势比野生型弱。. 受本基金资助，在计划的研究内容之外，我们还完成了低温胁迫下山葡萄转录组的测序、功能注释与分析，解析了山葡萄抗寒性状形成的分子基础，获得了 6,850 个低温响应基因， 其中包括一批感知早期冷胁迫重要的上游信号转导基因：钙离子信号蛋白，类受体激酶（RLKs）以及蛋白激酶基因（CIPKs）等；探索了可变剪接事件在低温胁迫中的作用。根据转录组数据，选取了上调表达显著的碱性螺旋-环-螺旋转录因子基因家族中1个成员进行了功能鉴定及调控机理分析，获得了株高发生显著改变的转基因葡萄材料，为后续抗寒功能分析及种质创新奠定基础。. 在项目执行期间，共发表与本研究相关（标注本项目资助）的SCI论文3篇，包括 《Plant Molecular Biology》、《PloS One》与《Molecular Biology Reports》。