新疆狗牙根抗寒分子标记的开发及抗寒基因克隆研究

本研究以搜集的152份抗寒性不同的狗牙根材料为研究对象，在已获得可区分资源遗传差异的SSR、SRAP分子标记的基础上，进一步对Genebank中的抗寒EST和狗牙根EST进行筛选，设计SSR引物，对供试狗牙根材料进行PCR 扩增，筛选多态性引物。利用已获得的多态性SSR、SRAP、EST-SSR引物对狗牙根材料进行扩增，采用关联分析法，筛选与狗牙根抗寒性相关的SSR、EST-SSR、SRAP分子标记，并在抗寒与寒敏感基因池进行验证，以筛选出的与狗牙根抗寒紧密相关的分子标记对抗寒与寒敏感基因池进行PCR扩增，获得等位差异条带。以此差异条带为基础，利用生物信息学的方法，克隆狗牙根抗寒cDNA全长，为探讨狗牙根的抗寒分子机制、克隆抗寒基因、辅助抗寒狗牙根育种工作奠定基础。

新疆狗牙根具有很强的抗寒性，有雪覆盖条件下-32℃能够安全越冬，在暖季型草坪草中, 是一种非常珍贵的抗寒种质资源。项目拟开发狗牙根抗寒性EST-SSR标记，利用关联分析法和BSA分析法，筛选狗牙根抗寒鉴定可用的分子标记；以此差异条带为基础，利用生物信息学的方法，克隆狗牙根抗寒cDNA全长，为探讨狗牙根的抗寒分子机制奠定基础。主要结果如下：（1）对各材料的表型性状进行细致鉴定，对各材料的抗寒性进行系统评价，并结合分子标记的手段为抗寒与寒敏感的材料建立了数字指纹图谱。结果表明新疆野生狗牙根在外部形态上存在广泛变异，11个表型性状的变异系数介于12.50～32.35%之间，总平均变异系数为25.15%，其中以叶层高度、叶片长度变异最大。（2）利用不同类型的分子标记对狗牙根材料进行基因组扫描，在设计600余对引物中，筛选出的159对多态性标记。综合SSR、EST-SSR标记对新疆野生狗牙根的遗传多样性分析,结果表明狗牙根材料具有较高的遗传多样性。SSR标记的多态性百分率为87.86%，EST-SSR标记多态性条带比例为92.5%。Nei’s基因多样性指数(H)变异范围为0.2442~0.4998，平均为0.4145。根据聚类结果，131份材料在相似系数为0.5时可聚为3类。（3）利用这些标记剖析了狗牙根的群体结构。当群体数目 k=4 时，可将供试材料分开，存在亚群结构。利用SSR、EST-SSR 分子标记对狗牙根基因组 LD 结构进行粗略估计，159个SSR、EST-SSR标记中共检测到6654 种位点组合存在连锁不平衡，占所有可能成对位点组合的 38.8%，其中 237个成对位点组合存在较高程度的连锁不平衡（D’＞0.5）。（4）根据表型数据和基因型数据，利用关联分析的方法对与抗寒性相关的位点及等位变异进行了挖掘。共检测到 11个位点分别与抗寒性状在 p＜0.05 水平上显著相关。利用分子克隆的技术手段，对关联位点相关基因进行电子克隆。共收集32个差异片段，经扩增有产物的为29个，回收率为90.6%。经过Blastn 检索，片段ES298174-2与玉米的低温诱导蛋白基因6A(LTI6A)同源性为78.7 %，与狼尾草经低温与盐诱导的mRNA 片段有93%的同源性。克隆狗牙根抗寒cDNA全长，最终获得了一条937bp的基因片段，初步构建遗传转化及表达体系验证功能。