奇异甲烷氧化菌Crenothrix类微生物的生态功能和底物氧化途径研究

Crenothrix in γ-Proteobacteria is called as "unusual" methane oxidizing bacteria, because its functional key gene is more similar with ammonia oxidizing bacteria in β-Proteobacteria. Through the functional gene based microbial population analysis, we found that the normally ignored Crenothrix-related microorganisms are the main part of methane/ammonia oxidizing bacteria. In this study, we will confirm the distribution and their environmental characteristics of Crenothrix-related microorganisms; and incubate environmental samples in laboratory with different substrate (such as methane, ammonia or ethane) and electron acceptors (such as oxygen, sulfate, nitrate or Fe(III))to find the growth condition of Crenothrix-related microorganisms and their ecological function in nutrient cycles; based on these results, we will do targeted enrichment with subsequent subculture, and understand the substrate oxidation pathway at the genomic level. The study of Crenothrix-related microorganisms not only will extend our knowledge of methane/ammonia oxidizing bacteria and their contribution in ecological environments, but also will contribute for the understanding of evolutionary relationship of methane oxidizing bacteria and ammonia oxidizing bacteria.

Crenothrix是属于γ-变形菌纲的甲烷氧化细菌，但其参与甲烷氧化的关键酶基因序列却与属于β-变形菌纲的氨氧化细菌更为接近，所以被叫作奇异（unusual）甲烷氧化菌。我们基于功能基因进行微生物群落结构的分析，发现常被忽略的Crenothrix类微生物是滩涂等多个环境中最主要的甲烷/氨氧化细菌类群。本研究中,将分析Crenothrix类微生物的生态分布及其环境特点；并采用不同底物（甲烷、氨或乙烷等）和电子受体（氧气、硝酸盐、硫酸盐或三价铁等）进行实验室培养，确定Crenothrix类微生物的生长条件并阐明它们在物质循环中的生态功能；以此为基础，进一步通过持续传代培养进行定向富集，并在基因组水平解析其氧化底物的代谢途径。Crenothrix类微生物的研究,将增进人们对甲烷/氨氧化微生物类型和它们在生态环境中作用的认识，并且对甲烷氧化细菌和氨氧化细菌进化关系的研究也具有重要意义。

本课题立项时，所关注的是被认为奇异甲烷氧化菌Crenothrix的颗粒性甲烷单加氧酶pmoA基因，因此开展了甲烷等气态烷烃氧化相关微生物富集的研究。在甲烷氧化富集物中不直接参与甲烷氧化的嗜甲基菌所占比例远高于甲烷氧化菌的量；为了认识这些非甲烷氧化微生物在甲烷氧化过程中的作用，我们从富集物分离了嗜甲基菌属的菌株TWE2并完成了其全基因组分析。通过对奇异甲烷氧化菌的pmoA基因丰度较高的过滤自来水滤膜样品的富集培养，发现此基因的拷贝数在氨氧化条件下明显增加，而在甲烷氧化条件下并无明显变化，由此认识到在本课题关注的“Crenothrix pmoA”基因所对应的不是甲烷或乙烷氧化微生物，而是氨氧化微生物。2015年的Nature报道也证实这一结果，并确认了此基因是全程硝化菌（comammox）的氨氧化单加氧酶amoA基因。我们通过添加不同底物（氨、尿素或亚硝酸盐等）尝试富集培养这类微生物，并用定量PCR方法检测富集体系中全程硝化菌和其它硝化相关微生物的丰度变化。通过几年的富集，已稳定富集到属于Clade A.2并含有质粒的全程硝化菌，区别于已报道的Clade A.1的富集物。并通过传代培养过程的研究，解释了全程硝化菌在生长过程中对不同底物的利用特性及其生长特点。此外，还建立了从广泛的环境样品中分析全程硝化菌种群组成的部分巢式PCR方法，并利用此方法确认了滩涂、自来水、活性污泥等环境样品中全程硝化菌的广泛分布，并发现全程硝化菌amoA基因多样性高于传统氨氧化细菌。对公共元基因组数据库中amoA基因分布的结果也支持一些自来水、污水处理等系统中全程硝化菌的量明显高于氨氧化细菌或氨氧化古生菌。本课题在全程硝化菌被发现之前已开展相关工作，研究了其生态分布特点，并通过富集培养认识到其氨氧化特点，最后富集到属于Clade A.2的含有质粒的全程硝化菌，并完成了全基因组分析。这些结果为进一步研究全程硝化菌的生理生化特点以及其在生态系统中的功能和贡献打好了坚实的基础。