香蕉后熟关键转录因子MADS2调控后熟过程的分子基础

MADS-box genes are important transcription factors that are closely related to fruit ripening. Recent report revealed that MADS2 played a critical role in modulating the ripening process of banana. But no researches on identification and functional analysis of interaction proteins and target genes of MaMADS2 were reported. This proposal aim to screen the interaction proteins of MADS2 through Yeast Two-Hybrid system on the one hand. The interactions between candidate proteins and MADS2 will be further confirmed with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and Co-Immunoprecipitation (Co-IP) methods. Meanwhile, we will analyze the expression of true interaction factors in development and postharvest of fruits. The functions of several true interaction proteins will be disclosed by creating overexpress plants or mutated-plants using CRISPR/Cas9 system. On the other hand, the targets of MaMADS2 will be globally identified by combining Chip-seq and RNA-seq analysis with MADS2:3×FLAG plants as the materials. Examination of the predicted functions of MADS2 targets will reveal the possible metabolic pathways or biological processes that regulated by MaMADS2. The outcome of the proposed research will be helpful for understanding the molecular networks of ripening process that modulated by MADS2, and provide theoretical foundation for banana genetic improvement aim to delaying the fruit ripening and extending shelf-life.

MADS-box基因是与果实成熟密切相关的一类转录因子基因，最近的研究表明香蕉中MADS2基因在果实后熟过程中起着非常重要的作用。然而目前对于MaMADS2互作蛋白及其调控的靶标基因的鉴定未见报道，本项目拟采用酵母双杂的方法鉴定MADS2的互作蛋白，并用双分子荧光互补和免疫共沉淀的方法验证其互作；进一步分析互作蛋白在果实发育和后熟过程中的表达特性，并通过超表达和基因编辑突变重要互作蛋白进一步分析其生物学功能。同时以MADS2:3×FLAG转基因果实为材料，利用Chip-seq和RNA-seq相结合的方法全面鉴定MaMADS2的靶标基因，通过对靶标基因的功能预测，分析鉴定其调控的靶标基因和代谢途径。本项目的研究结果对于更深入认识MADS2在香蕉后熟过程中的作用机理，全面解析MADS2影响后熟过程的调控网络具有重要的理论意义，为以控制后熟过程和延长货架期为目的香蕉遗传改良奠定基础。

香蕉是典型的呼吸跃变型果实，其对乙烯非常敏感，采收后的果实在常温下能很快出现乙烯高峰，成熟启动后果实在一周内迅速腐烂变质。这极大地限制了香蕉产业的发展。因此，研究果实成熟的分子调控机制对采后果实的品质保持及保鲜技术的研发具有着重要的理论和实际意义。在香蕉中前期有研究显示MADS2转录因子在果实的后熟过程中起重要调控作用，其RNAi能明显延缓果实采后的成熟过程。本项目是进一步利用挖掘MADS2l转录因子的主要互作蛋白和下游直接调控的靶基因。探讨MADS2调控香蕉后熟过程的分子基础，为全面解析香蕉果实后熟的调控机制提供新的线索，最终为香蕉果实采后品质保持与贮运性改良提供理论基础。主要结果如下：1.利用香蕉果实建立了高质量的酵母双杂文库，初级和次级文库的库容分别为2.9×106 cfu•mL和3.2×106 cfu•mL，平均插入片段大小在1200 bp以上；2.通过酵母双杂筛库最终鉴定出13个与MADS2具有相互作用的候选蛋白，其中包括8个转录因子，3个E3泛素连接酶，2个是有转录抑制作用的蛋白，而且通过双分子荧光互补进一步确认了3个候选蛋白与MADS2互作情况，这其中包括1个E3泛素连接酶。进一步分析MADS2蛋白的表达发现，其在果实后熟过程中蛋白水平逐渐降低，暗示E3泛素连接酶可能通过互作调控MADS2的水平来参与后熟过程；3.通过酵母双杂、双分子荧光互补实验及免疫共沉淀实验证实了MADS2、MADS1及MADS5三个转录因子两两之间存在相互作用，说明其可以以复合物的形式发挥调控作用，且发现MADS5的K结构域是它们之间互的关键结构域；4.对香蕉A基因组中NAC转录因子进行分析，鉴定出10个与果实成熟密切相关的转录因子基因，部分具有明显的转录激活活性，部分具有转录抑制活性，且发现在三个MADS-box转录因子中，MADS5是调控成熟关键因子NAC94的主要调节因子；5.通过酵母单杂筛库，鉴定出30多个MADS2转录因子可以直接结合的motif序列；6.MADS2转录因子对与果实软化相关的PL（Pectate lyase）基因具有调控作用，且同时通过酵母单杂鉴定到一个对PL基因具有调控作用的WRKY转录因子。