一氧化氮与细胞色素c反应基础及其对线粒体凋亡机制的初步研究

The results of reaction mechanism between nitric oxide which is a biological messenger molecule and cytochrome c(Cytc) will help to investigate thoroughly the important scientific problems with the relevant Cytc, such as programmed cell death, biosynthesis of fatty acid amide et al. For this project, we have carried out partial work and gained the reaction course of different valence Cytc and NO. Yet their reaction intermediates, products, and effect on cell biological function are elusive. In this project, we will deep research reaction process，intermediate type，metabolite type of Cytc and NO, acknowledge the two reaction mechanism by means of electron paramagnetic resonance(ESR), laser flash photolysis, biomolecular interaction instrument(Biacore X100), cyclic voltammetry, stopped-flow, circular dichroism (CD) and so on chemical, physical techniques, and that we will survey effect of two reaction on cell activity, especially the activity and apoptosis of mitochondria in cells by cell culture technique, detection of enzyme activity, flow cytometry and Confocal laser scanning microscopy(LSCM) and so on, which will contribute to study the apoptosis mechanism of mitochondria affected by Cytc and NO. In a word, these results of the project will directly be in favor of understand the mitochondria apoptosis affected by Cytc and NO.

生物信使中的一氧化氮分子（NO）与细胞色素c（Cytc）反应机制研究将有助于探究与Cytc相关的细胞程序性死亡、脂肪酸酰胺的生物合成等科学问题。本课题前期已经开展Cytc与NO的相关工作，探讨不同价态Cytc与NO的反应过程，但二者反应中间态、产物类型、以及对细胞生物功能产生哪些影响都仍没有确切的研究结果。本课题以Cytc为研究对象，利用电子顺磁共振技术、激光闪光光解技术、生物大分子相互作用仪、循环伏安法、在线停留技术、圆二色光谱等化学、物理学方法深入研究Cytc与NO反应的过程，探究中间过渡态、代谢产物类型，确定二者的反应机制。利用细胞培养技术、酶活性检测技术、流式细胞仪和激光共聚焦显微镜等方法观察二者及二者反应产物对细胞引起的反应，重点对细胞内线粒体活性和凋亡的影响，探讨在NO和Cytc反应产物影响下线粒体的凋亡机制。实验结果将直接有利于解决Cytc和NO双重调节下对线粒体活性的影响。

NO和Cyt c作为生命体内的必需物质具有多种重要的生理功能，例如NO对信号转导、血管调节、神经传递、免疫功能等以及Cyt c对细胞呼吸链中的电子传递、细胞程序性死亡等等重要的生物功能，二者关系到生物的生长、发育、衰老等生命进程。因此对NO和Cyt c的配位研究意义重大。本文重点是考察NO与Cyt c反应的进程以及机制，进一步探讨二者反应过程对细胞凋亡的影响。. 重点研究了几个方面的内容：1.不同价态的Cyt c与NO气体（ProliNONOate）之间的反应，得出Cyt c-Fe(III)直接与NO进行配位反应，而Cyt c-Fe(II)与NO反应时，先被氧化生成Cyt c-Fe(III)在与NO反应，反映最终都是Fe-S(Met)键断裂，形成Fe-N键。同时根据荧光猝灭机制，研究了Cyt c与NO结合机制，二者以1：1结合，主要依靠静电引力完成的自发吸热过程。进一步研究不同的外界因素不同NO、O2、离子强度、pH、温度、缓冲溶液、拥挤试剂、氨基酸、光照和还原性物质等物理、化学因素对二者结合的影响，并且得出光照和氨基酸的添加对二者结合影响不同的机制。2. 第二方面详细分析了Cyt c与NO形成的二元复合物解离的过程以及动力学分析，以及不同外界因素对接力动力学的影响等。3.同时分析了结合、解离不同过程中Cyt c蛋白质空间构象的变化。4.在此基础上研究其它的血红素蛋白HRP、肌红蛋白及其突变体与NO的相互作用，得出一些重要的结果。5. 发明了一种用于光谱实验给比色皿中溶液通气的装置，便于有气体操作的实验的开展。发明了一种固定化的荧光胞色素c制备方法，能够灵敏的检测NO的浓度。利用有机合成的方法合成处一系列的蒽醌类化合物，可以用于NO的定量分析，这两类用于NO检测探针的制备为以后NO的定量分析提供了有效的方法。. 本课题发明专利具有很大的使用价值，NO检测探针可以用于实际中NO的定量分析，通气装置可用于气体实验的开展。而本课题得出上述主要的数据和结果，为进一步关于NO以及Cyt C的研究，奠定一定的理论基础，我们仍要继续深入研究二者共同作用在生命体的功能意义，继续探讨NO、Cyt c的功能以及揭示生命的奥秘。