细胞色素C介导牛肉凋亡酶系级联反应机制研究

Tenderness is the major factor that determines the quality of beef and grading. In recent years, it has been found that the caspase in the postmortem beef early activated and hydrolysis could improve the tenderness of the skeleton protein. Cytochrome C may mediate caspase cascade reaction, but the reaction mechanism is not clear. The project make the beef and yak muscle as experiment material, using CO immunoprecipitation technology, spectral structure analysisand bioinformatics technology, research the activator in the cytoplasm of the muscle sites of action of Cyt-c N-terminal phosphorylation modification methods and itself, exploring the Cyt-c amino terminal Apaf-1 poly phosphoric acid on the cell environment energy level adjustment mechanism; to determine the apoptosis of complex and caspase-9 Cyt-c N-terminal Apaf-1 poly phosphoric acid to form the binding domain of molecular sequences of DNA, combining the observation before and after caspase-9 three level structure change and its molecular fragment into caspase-3 plasminogen fragment self splicing process; research Cyt-c N-terminal Apaf-1 poly phosphoric acid as the inducing factor stimulate caspase-3 activity in vitro and in vivo, skeletal protein degradation, and injection of exogenous Zn2+ induced Cyt-c N-terminal Apaf-1 poly phosphorylation regulation cascade reaction of caspase, revealed Cyt-c N-terminal Apaf-1 poly phosphorylation mediated caspase cascade reaction mechanism, in order to enrich and develop the theory of mature beef tenderness.

嫩度是决定牛肉品质和分级的主要因素。近年发现凋亡酶系（Caspase）级联反应在宰后牛肉早期被激活并对细胞骨架蛋白进行水解改善嫩度，细胞色素C（Cyt-c）有可能介导Caspase级联反应，但反应机制尚不清楚。本项目以肉牛牦牛肌肉为材料，采用免疫共沉淀、光谱结构解析和生物信息学等技术，研究肌肉胞浆中各活化因子对Cyt-c氨基端的作用位点及本身磷酸化修饰途径，探索Cyt-c氨基端促凋亡因子-1（Apaf-1）多聚磷酸化对细胞环境能量水平的调节；确定Apaf-1磷酸化形成的凋亡复合体与Caspase-9结合域的DNA序列，观察Caspase-9结构变化及自剪切成Caspase-3过程；研究Apaf-1磷酸化诱发Caspase-3活力以降解体内外骨架蛋白，并注射Zn2+诱导调控该过程。揭示Cyt-c氨基端Apaf-1多聚磷酸化介导Caspase级联反应机制，以期丰富和发展牛肉成熟嫩化理论。

以肉牛牦牛肌肉为材料，利用蛋白免疫印迹技术探究了宰后牛肉成熟过程中Cyt-c介导凋亡发生的机制及对嫩度影响，采用蛋白质组学技术阐明了细胞凋亡活化因子的磷酸化修饰及线粒体膜凋亡蛋白表达，明确了促凋亡因子（Apaf-1）磷酸化对细胞环境能量水平及Caspase-3活化的影响；利用光谱结构解析技术揭示了Cyt-c磷酸化修饰过程中其高级结构变化及与细胞凋亡的关系；利用细胞生物学手段解析了Caspase-3对牛肉细胞骨架蛋白降解作用及外源性Ca2+、ROS调控Caspase级联反应进而改善嫩度的机制，为牛肉品质的形成和控制提供新的理论依据和方法。主要研究结果如下：1. 明确了细胞凋亡的发生及其对嫩度的影响：宰后前期，Cyt-c从线粒体释放到胞浆，启动Caspase-9的激活，并活化下游的Caspase-3，诱导凋亡发生，改善肌肉嫩度。Cyt-c介导Caspase级联反应机制的发生在两种牛肉类型（牦牛和肉牛）中没有差异。因此，本研究以肉牛、牦牛肉为试验材料。2. 确定了细胞凋亡活化因子的磷酸化修饰及线粒体膜凋亡蛋白表达变化：Cyt-c可能通过破坏核糖体相关蛋白阻碍了蛋白质的正常合成途径、下调锌指蛋白阻碍相关凋亡因子（Bcl-2）的表达，进而阻碍DNA的合成，从而诱导细胞凋亡发生。3. 明确了Apaf-1磷酸化对细胞能量水平及Caspase-3活化的影响：线粒体膜通透性增大，导致Cyt-c释放，介导凋亡小体Apaf-1的形成。此时，能量效应酶活力达到最大值，启动了离子交换系统，反作用于线粒体膜，介导Caspase-3发生活化，加剧了细胞凋亡的发生。4. 揭示了Cyt-c介导细胞凋亡的发生与Fe配体振动相关拉曼光谱频率相关，宰后成熟过程中Fe配体振动相关拉曼光谱频率红移，促进Cyt-c与线粒体膜结合，诱导凋亡发生。5. 解析了Caspase-3对肌原纤维蛋白的水解作用以及细胞骨架蛋白降解。6. 阐明了Ca2+调控细胞凋亡是通过Ca2+稳态失衡影响能量代谢酶活性，进而使得线粒体膜结构发生损伤，引起Cyt-c释放，诱导凋亡发生。7. 确定了氧化应激调控细胞凋亡是通过调控线粒体Ca2+含量和Bax/Bcl-2的水平，引起Cyt-c的释放。综上，本研究从细胞层面、蛋白质分子层面及肌肉嫩度层面，深入探究了Cyt-c介导Caspase级联反应机制，为揭示牛肉宰后成熟嫩化机制提供了新的理论依据。