细胞色素C在杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡中的作用

线粒体凋亡途径受到细胞色素C释放的介导，细胞色素C从线粒体释放到细胞质是线粒体介导凋亡信号转导最重要的事件。但是，昆虫细胞凋亡中细胞色素C释放与否尚存歧异。本项目在初步确定杆状病毒诱导昆虫细胞凋亡中存在细胞色素C释放事件的基础上，利用荧光标记抗体,测定AfMNPV诱导斜纹夜蛾SL-1细胞凋亡中细胞色素C的释放、定位和动态变化；电镜观察病毒诱导凋亡细胞线粒结构变化与细胞色素C释放的关系；构建SL-1细胞的无细胞凋亡体系统，分析细胞色素C对无细胞体系凋亡的影响；分析和测定病毒诱导凋亡细胞中凋亡体的存在、凋亡体的构成以及相关成分的活性；应用RNAi技术，干扰细胞色素C表达，研究其对细胞凋亡、caspase-3活性变化等的作用与影响，在不同水平上系统研究细胞色素C在杆状病毒诱导磷翅目昆虫细胞凋亡中的地位与作用，揭示其作用规律，为最终阐明细胞色素C在昆虫细胞凋亡中的作用及机制提供科学依据。

细胞色素C介导线粒体凋亡信号途径在哺乳动物细胞凋亡中业已证明具有普遍性，但是在昆虫细胞中存在巨大分歧。本项研究较为系统、深入地分析了细胞细胞色素C在杆状病毒诱导斜纹夜蛾Sl-1凋亡中的作用，项目研究取得重要研究结果和成果。1.AfMNPV诱导Sl-1细胞凋亡导致线粒体结构变化。免疫荧光标记显示，杆状病毒感染引起细胞线粒体聚集分布和以后的荧光扩散，提示病毒诱导细胞线粒体结构损伤和去极化。电镜研究揭示病毒诱导凋亡的斜纹夜蛾细胞线粒体结构发生明显的变化，线粒体肿胀、变圆，嵴减少且空泡化，在病毒诱导细胞凋亡过程中，伴有线粒体结构的显著变化，线粒体结构破坏预示可能与细胞色素C释放存在联系；2.免疫荧光双染色显示细胞色素C从线粒体释放。免疫荧光双染色显示细胞色素C与线粒体二者不共定位，这进一步证明了我们以前Western blot分析的结论：即细胞色素C释放是鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中细胞色素的重要事件；3.Sl-1细胞凋亡的无细胞体系显示细胞色素诱导无细胞体系的凋亡。利用Sl-1细胞浆制备的无细胞体系作为反应体系，以外源细胞色素C作为诱导剂，诱导了Sl-1细胞核发生凋亡，同时伴有DNA的片段化与caspase-3的活化，显示细胞色素C具有凋亡诱导功能；4. 干扰细胞色素C表达明显抑制杆状病毒诱导的细胞凋亡。沉默细胞色素C的表达，明显抑制了AfMNPV诱导Sl-1细胞的凋亡，细胞凋亡水平明显下降，caspase-3和caspase-9活性明显降低，说明杆状病毒诱导Sl-1细胞凋亡，caspase的活化依赖于细胞色素C；5.凋亡体抑制剂FSBA抑制杆状病毒诱导的细胞凋亡。FSBA处理导细胞凋亡明显降低，caspase-9和caspase-3活性均下降，预示在杆状病毒诱导鳞翅目昆虫细胞凋亡过程中会形成凋亡体。同时，分子杂交检测到凋亡体核心成分Apaf-1。此外，caspase-9抑制剂Z-LEHD-FMK即抑制caspase-9活性，也抑制了caspase-3活性，提示杆状病毒诱导Sl-1细胞的凋亡途径中存在caspase级联。这些研究表明细胞色素C在杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡中具有重要作用,在鳞翅目昆虫细胞凋亡中存在细胞色素介导的凋亡信号通路，这些结果为进一步解析Apaf-1的引擎作用和凋亡体形成等下游事件，全面解读杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡分子机制奠定了坚实的基础。