自交不亲和信号转导途径中磷酸化蛋白质的研究

蛋白质磷酸化是生物体内一种重要的分子调控机制，在细胞信号的传递过程中具有重要的作用。现已研究表明，芸苔属植物自交不亲和（SI）是通过柱头乳突细胞膜上的受体蛋白激酶SRK和细胞质蛋白质激酶MLPK形成的信号复合体，介导细胞质内的蛋白质磷酸化，从而引起SI反应，但目前对于柱头细胞内的SI分子调控机制知之甚少。因此，在本项研究中，我们收集自花授粉与异花授粉后的柱头，提取柱头总蛋白质，利用2-D DIGE和Pro-Q磷酸化蛋白染色的方法进行差异表达蛋白及磷酸化蛋白质的检测分析，通过质谱鉴定及谱图分析磷酸化蛋白质的修饰位点；利用生物信息学的方法分析和预测磷酸化蛋白质的结构和功能，通过体外激酶反应分析检测SRK与MLPK对筛选到的蛋白质磷酸化情况，免疫印迹的方法检测筛选到的磷酸化蛋白质在授粉过程中的水平变化，从而阐释筛选到的磷酸化蛋白质在自交不亲和信号转导上的功能。

蛋白质磷酸化是生物体内一种重要的分子调控机制，在细胞信号的传递过程中具有重要的作用。目前认为蛋白质磷酸化与去磷酸化途径参与芸苔属植物的授粉过程。在本课题研究中，为了分离在授粉过程中蛋白质的变化，收集自花授粉与异花授粉后的柱头，采用TCA/丙酮的方法提取柱头的总蛋白质；利用CyDye荧光染料标记样品，进行pH 4-7的胶条2-D电泳分离，利用Typhoon 9400荧光扫描仪扫描样品，应用DeCyder软件进行差异蛋白点分析与筛选。在自交授粉后差异柱头蛋白的分析中，获得了90个差异点；通过MALDI-TOF/TOF质谱分析有46个蛋白被鉴定出来。其中14个蛋白质上调表达，32个蛋白质下调表达；在异交授粉后差异柱头蛋白的分析中，获得了50个差异点，有19个蛋白被成功的鉴定出来。其中有8个蛋白质上调表达，11个蛋白质下调表达。这些蛋白质主要是参与代谢途径、胁迫反应、蛋白酶抑制剂、分子伴侣、细胞壁重组、信号转导等。由于磷酸酶处理前后磷酸化蛋白的分子量及等电点会发生变化，反应在DIGE凝胶上则是蛋白点表达量的变化。利用磷酸酶处理授粉后样品，检测到132个在磷酸酶处理前后电泳迁移率发生变化的蛋白。利用MALDI-TOF-TOF质谱分析，得到73个蛋白的高可信度注释信息。将获得的磷酸化蛋白利用GO进行了分析，刺激响应蛋白占较大比重，分类中包含生物刺激响应、胁迫响应、主要代谢过程、单个-多个细胞生物体过程、有机物代谢过程、细胞代谢过程等。通过分析上述获得的差异蛋白，筛选Bnm1基因，peroxiredoxin-2B基因、Lactoylglutathione lyase基因、Cysteine synthase基因和glutamine syhthetase cytosolic isozyme 1-2基因进行克隆和分离。利用实时定量PCR技术，检测基因在羽衣甘蓝的根、茎、叶和柱头的相对表达量情况。通过原核表达纯化技术获得筛选到目的基因的融合蛋白和SRK13b的激酶域融合蛋白。在体外的激酶检测中，进行SRK13b激酶的下游底物筛选，但目前没有获得阳性结果。在亚细胞定位研究中发现，peroxiredoxin-2B、Lactoylglutathione lyase在细胞质和细胞核内都有表达。通过上述研究，为授粉过程和自交不亲和信号通路的研究提供了线索。