EgTOE1调控草原龙胆可育性重瓣花形成机制研究

The number of petals in a flower is one of the most important appearance qualities of ornamental flowers. In Eustoma grandiflorum, the number of petals fluctuates significantly and little is known about how it is controlled. Our team has collected many different Eustoma grandiflorum cultivars with diverse characteristics in flower shape, color and size. In previous work, we have found that the EgTOE1 may participate in double flower formation by using the genetic analysis and map based cloning approach in segregating populations derived from a cross of single flower cultivar with and double flower cultivar. The EgTOE1 in double flower cultivar is a gain of function mutation in contrast to the single flower cultivar. In this work, we will figure out the mechanisms of EgTOE1 controlling double flower formation in Eustoma grandiflorum by a series of studies, such as: gene over-expression and gene editing by genetic transformation; analyze the expression pattern of genes related to flower development by ChIP-qPCR and qRT-PCR; screening the EgTOE1 interacted proteins by IP-MS. Our findings will provide novel insights into the molecular mechanisms of Double flower formation with fertilizability in Eustoma grandiflorum and also be very helpful for breeding new Double flowers cultivars in ornamental plant.

草原龙胆具有典型的单轮又有多轮花器官，花器官是重要的园艺观赏性状，尤其是花瓣的轮数往往作为园艺观赏植物的育种目标。本研究团队多年来致力于草原龙胆资源收集、纯系制备及品种选育研究，前期利用遗传分析方法，通过草原龙胆单、重瓣的品种杂交获得F1代，自交获得F2代群体，利用RAD测序技术Mapping到单、重瓣花差异基因EgTOE1，初步分析重瓣花为EgTOE1+获得性突变体。本项目将利用转基因及基因编辑技术研究EgTOE1基因的功能，利用ChIP-qPCR及qRT-PCR技术筛选EgTOE1调控的特异的B、C类基因及明确在单、重瓣花中调控的模式的差异，利用IP-MS技术在单、重瓣花中筛选与EgTOE1相互作用的差异蛋白。最终明确基部合瓣花多轮花瓣形成且可育的机理，其结果将对园艺植物重瓣花新品种的育种奠定理论基础。

草原龙胆因其花色、花型丰富而成为国际流行的鲜切花，本研究团队为研究重瓣花的形成机制，利用多年自交获得单瓣及重瓣的草原龙胆自交纯系，杂交获得F1代，F1代自交获得大量的F2代群体，进行遗传分析及高通量测序，并进行了图位克隆及精细定位，Mapping到了决定单瓣与重瓣差异的关键基因EgTOE1，对单重瓣草原龙胆中EgTOE1进行序列分析，发现重瓣花中产生了三个不同位置的非同义突变，经分析其中一个位点是与miR172结合的重要位点。在草原龙胆原生质体中，验证miR172与EgTOE1/EgTOE1+相互作用，结果表明，该位点的突变导致EgTOE1+受miR172抑制作用减弱。为了明确EgTOE1/EgTOE1+表达特性，及EgTOE1+在花器官发育中重要作用。通过组织原位杂交及实时定量PCR，在野生型单、重瓣草原龙胆中，确定EgTOE1/EgTOE+及 B、C类基因在不同发育阶段的不同花器官中的表达。结果显示，发现单重瓣EgTOE1/EgTOE1+主要在原基和花芽分生组织中转录；EgAG类基因的表达仅限于雌蕊和心皮表达；而在重瓣花中，EgGLO2的表达较在单瓣花中开始时间较晚且表达不均匀。另一方面，在不同发育阶段重瓣花中EgTOE1+的表达量与单瓣花的情况大致相同，均随着发育而表达减少，但是，单瓣花减少幅度较大，而重瓣花则显示出相对缓慢的减少趋势。C类基因与EgTOE1相反随着发育而表达增多，但重瓣花中的表达量比在单瓣中的要低得多。在不同花器官间也表现为类似的结果，且B类基因在重瓣花中的表达量相较于在单瓣中的也有所降低。因此推测EgTOE1/EgTOE1+不仅拮抗C类基因的表达，很可能也充当B类基因在第一轮表达的抑制子。初步解析EgTOE1+调控重瓣形成的分子机制，明确 EgTOE1+及相关调控因子在花器官发育中重要作用，分析并构建草原龙胆可育性重瓣花形成分子模型。