自噬与AVM致鸽脑神经细胞损伤中α-突触核蛋白聚集的相关性研究

α-突触核蛋白(α-synuclein)异常聚集引起神经细胞死亡是导致动物患神经退行性疾病的原因之一。研究表明α-synuclein的异常聚集与自噬密切相关。AVM诱导可致动物出现神经退行性病变，α-Synuclein的聚集增加，但其与自噬间的关系尚不清楚。本课题拟在克隆鸽微管相关蛋白 (LC3-Ⅱ)和动力蛋白(Dynein)基因序列并制备抗鸽LC3-Ⅱ和Dynein单克隆抗体的基础上，通过复制AVM致鸽神经细胞损伤的体内、外模型，采用实时PCR、Western-blot、透射电镜和激光共聚焦技术，检测自噬数量，α-Synuclein、LC3-Ⅱ和Dynein基因表达量与蛋白含量，以及α-Synuclein、LC3-Ⅱ和LAMP-1共定位，探讨自噬与AVM致鸽脑神经损伤中α-synuclein聚集的相关性，为AVM生态毒理学评价提供详实的基础资料，同时也为比较医学提供有价值的理论借鉴。

本研究采用qPCR、免疫印迹杂交、透射电镜和RNA干扰技术，检测了体内、外条件下AVM染毒前后自噬的形态学变化情况，α-Synuclein、LC3-Ⅱ和Dynein基因表达量，以及干扰α-Synuclein后AVM体外染毒条件下上述实验指标的变化情况，主要结果如下：（1）成功克隆了297 bp的王鸽微管相关蛋白 (LC3-Ⅱ) 和462 bp动力蛋白(Dynein)的cDNA序列，应用原核表达系统在体外条件下分别合成了大小为11KD和17KD的蛋白，免疫后分别获得了效价为1:25600和1:12800的特异性良好的抗鸽LC3-Ⅱ和Dynein的抗体。（2）体内AVM染毒条件下，不同剂量的AVM在不同时间点能引起王鸽大脑、小脑和视叶组织线粒体肿胀，自噬体，自噬溶酶体以及自噬空泡的出现，从形态学角度证明了AVM能够引起脑组织发生自噬，并且细胞中自噬体的数量与暴露时间和剂量呈正相关。（3）通过荧光定量PCR和Western Bolt技术检测脑组织自噬相关基因发现，亚慢性阿维菌素中毒后，与α-synuclein基因的表达异常升高相伴行，王鸽大脑、小脑和视叶中的自噬抑制基因TORC1和TORC2 mRNA表达下调，自噬促进基因LC3、Beclin 1、Dynein、ATG 5、ATG 4B 的mRNA表达升高和LC3、Beclin 1、Dynein蛋白表达升高，提示阿维菌素可通过改变自噬相关基因表达来诱导王鸽脑组织中自噬的激活。（4）体外AVM染毒条件下，随着染毒剂量的增加线粒体肿胀、自噬溶酶体和自噬空泡逐渐增加。相应的处理组中敲减α-syn蛋白的表达后自噬空泡的数量明显减少。（5）体外AVM染毒条件下，与α-synuclein基因的表达异常升高相伴行，王鸽脑神经细胞LC3、Beclin 1、Dynein、ATG5、TORC2和TORC1的mRNA表达水平和LC3、Beclin 1、Dynein的蛋白表达与对照组相比均显著增加。在敲低α-syn基因后上述基因的表达对AVM染毒的敏感性显著降低。本研究表明体内、外条件下，AVM诱导的鸽脑神经细胞的自噬增加与α-synuclein的异常表达升高相伴行，我们推测AVM诱导导致的α-synuclein的异常表达升高可能是导致自噬异常增加的原因，而后者可能是神经细胞退行性死亡的原因之一。