α-突触核蛋白在阿维菌素致鸽神经元细胞凋亡中的作用

α-突触核蛋白在环境毒素致细胞凋亡的过程中起着十分关键的作用，又与线粒体功能之间存在密切的关系。但其与阿维菌素致神经细胞凋亡及线粒体损伤的关系尚不清楚，本课题运用实时定量PCR、RNA干扰、免疫组化等方法，通过体内、体外试验，检测经阿维菌素染毒鸽脑组织中α-突触核蛋白的分布、表达情况，线粒体相关功能指标（ComplexⅠ、ComplexⅡ、ComplexⅣ、MPTP、mtDNA），c-fos、jun mRNA表达和细胞凋亡等，从分子水平探讨α-突触核蛋白在阿维菌素诱导神经元细胞凋亡及线粒体损伤过程中的分子机理，揭示阿维菌素的致毒机理，进一步明确阿维菌素致神经细胞毒作用的可能机制，加深对其机制的认识，为阿维菌素环境毒理学评价提供详实的基础资料，亦为环境毒理学的研究和比较医学提供借鉴。

α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）是一个由140个氨基酸残基构成的酸性蛋白，在神经细胞凋亡的过程中发挥着重要的作用。阿维菌素(Avermectin,AVM)作为农药和兽药使用时，通过污染土壤与水体进入到环境中，其毒性作用不仅影响到陆生生物和水生生物的群体生态平衡，对脊椎动物也有危害。本课题应用实时定量PCR、RNA干扰、免疫组化等方法，通过体内、体外实验，研究了α-Syn 与AVM鸽致神经元细胞凋亡的相关性。主要结果如下：①成功克隆了613 bp的王鸽α-Syn cDNA序列，与其他7个物种α-Syn编码区核苷酸序列同源性在81.71%~93.52%之间。应用免疫组化方法，在鸽海马、丘脑、嗅球、视叶、小脑中均检测到α-Syn，阿维菌素致鸽脑不同部位α-Syn mRNA 表达量的升高，具有差异性，说明AVM中毒引起的神经损伤与α-Syn表达增加有关。②应用荧光实时定量PCR 法检测细胞内α-Syn、bcl-2 mRNA 表达水平，结果显示阿维菌素能够引起王鸽脑神经组织内α-Syn mRNA表达水平增加，凋亡的标志性基因bcl-2 mRNA表达水平减少。③应用HE染色、透射电镜以及 TUNEL 法，从形态学角度验证了AVM 能够引发神经细胞凋亡，其细胞凋亡率与 AVM 作用程度呈正相关，且线粒体出现明显的结构变化。④AVM造成王鸽脑神经组织发生氧化损伤，影响其正常的生理机能，进一步诱导细胞凋亡的发生。⑤本试验成功的将Stealth RNA转染原代培养的鸽神经细胞中，转染的最适条件是：24孔板每孔加入1.0 μL RNAi MAX +20 μM siRNA之后，神经细胞中α-Syn mRNA表达水平降低，结合AVM染毒试验表明，α-Syn在AVM 致神经细胞凋亡中发挥重要作用。⑥检测了AVM中毒王鸽脑组织四种氨基酸类神经递质的含量及其受体表达情况。随着AVM中毒的剂量和时间的延长，GABA、Gly、ASP、Glu含量及其受体mRNA相对表达量与AVM中毒之间呈剂量时间效应增高趋势，其中以GABAAR mRNA的变化最敏感。炎症因子PEG、iNOS、NF-KB随染毒时间延长呈现升高趋势。⑦AVM中毒时肝、肾细胞氧化应激、结构变化以及细胞凋亡，同时P450酶系功能降低，caspase 3、caspase-8及Fas mRNA 表达增加。