胸膜肺炎放线杆菌OxyR转录因子抵御氧化应激机制的研究

Investigating the mechanism of microbial antioxidant stress will be helpful for further clarifying the mechanism of drug resistance and pathogenesis in bacteria. The transcription factor OxyR is a key regulator in response to oxidative stress in bacteria. It is a thiol-containing transcriptional activator which can bind DNA upon oxidation to control the expression of genes involved in H₂O₂ detoxification. We found the OxyR encoding gene in the genome of A. pleuropneumoniae, and the bacterial growth inhibition of H₂O₂ could be relieved by addition of Fe³+ in the H₂O₂ growth assay. These results indicated that OxyR may play an important role in regulating iron-related genes to relieve oxygen stress in A. pleuropneumoniae. Based on our previous studies, this project aims to use gene mutation, RNA-seq and iTRAQ technology to elucidate the mechanism of OxyR regulation. Chromatin immunoprecipitation assay will be used to analyze the promoter binding site of OxyR in the genome. The culture cell adhesion and animal challenge experiments will be used to analyze the virulence difference of OxyR deleting mutant. The project has a great significance for elucidating the OxyR biological function and pathogenesis of A. pleuropneumoniae, and laying the foundation for the prevention and treatment of bacterial infection by using OxyR as a drug target.

研究微生物抗氧化应激机制可以有助于深入理解细菌耐药性机制及致病机理。细菌中氧化胁迫的调控主要由转录因子OxyR负责。该因子是含有巯基的转录激活物，氧化后具有结合DNA的能力，进而激活与抗氧化胁迫相关基因的转录清除过氧化氢。申请者分析胸膜肺炎放线杆菌基因组发现OxyR基因；胸膜肺炎放线杆菌H₂O₂生长试验中加入Fe³+可解除H₂O₂的生长抑制。这暗示着OxyR转录因子在胸膜肺炎放线杆菌中可能调控铁代谢相关基因解除氧胁迫压力。本项目拟在此基础上，运用基因突变、RNA-seq和iTRAQ技术，阐明OxyR调控机制；运用染色质免疫共沉淀技术，解析OxyR启动子结合位点；利用细胞吸附和动物感染试验分析OxyR缺失突变株的毒力变化。项目的完成对阐明胸膜肺炎放线杆菌OxyR的生物学功能和致病机制具有重要意义，同时为人们利用OxyR作为药物靶标防治细菌感染奠定基础。

猪胸膜肺炎放线杆菌是一种重要的猪呼吸道病原细菌，具有较高的感染率和死亡率，能造成重大经济损失。胸膜肺炎放线杆菌在宿主细胞中抗氧化应激的能力是其存活的先决条件。OxyR是参与细菌抗氧化应激的主要转录调控因子之一，结构相对保守。然而，关于OxyR在胸膜肺炎放线杆菌中的生物学作用知之甚少。. 在本项目中，我们通过构建oxyR突变菌株研究OxyR的生物学功能。同母源菌株相比oxyR突变菌株生长能力减弱对过氧化氢和去铁胺的敏感性提高，分泌ApxⅠ毒素的能力增强2倍，过氧化氢酶活性增强近4倍，脲酶活性降低，对PK-15细胞的黏附和入侵能力降低了3倍，对小鼠的毒力降低近15倍。Chip-seq和凝胶阻滞实验分析结果表明，OxyR蛋白在体内外可直接结合ApxⅠBD和过氧化氢酶启动子的保守区域，可阻遏两者的转录。上述实验结果表明OxyR可以直接调控ApxⅠBD的表达从而间接调控ApxⅠ毒素的分泌。转录组联合蛋白组学分析比较oxyR突变菌株和母源菌株，观察到73个差异表达基因和蛋白质。这些差异表达基因和蛋白质参与广泛的生物过程，例如氧化应激、ABC转运和能量代谢。. 基于上述研究结果，我们初步提出Apx毒素抗氧胁迫机制的模型，即在氧化应激的条件下由OxyR感受活性氧信号释放ApxⅠBD启动子区并上调ApxⅠ毒素的表达，ApxⅠ毒素具有强溶血活性可帮助病原从宿主血细胞中获取铁离子，抑制芬顿反应进而减少自由基的产生，以提高细菌对氧化应激的耐受能力。研究结果为深入解析胸膜肺炎放线杆菌的抗氧化应激和致病机理具有重要的意义。