外泌体携带miR-152调控脂肪干细胞促创面愈合的机制研究

ASCs is an endothelial seed cell, ideal for hard-healing wounds, but is limited in application for its. unclear molecular mechanism of differentiation, which makes it difficult to control the differentiation degree. Literature has shown that exosome can regulate differentiation of stem cells, suggesting it may also exert influence in the process of ASCs differentiation into endothelial cells. In the previous study, the applicant found that ASCs induced by EPO facilitated process of ASCs differentiation into endothelial cells. miRNA chips and bioinformatics suggested miR-152 played an important role in the differentiation process by regulating EphrinB2. Further bioinformatics and target validation confirmed that EphrinB2 was one of the targets for miR-152. In the present research, the applicant is to study signal transduction caused by miR-152 controlling EphrinB2 and the molecular mechanism of ASCs differentiation into endothelial cells from aspects of cell, molecule and lesion repair, by using miRNA techniques, RNAi，and lentiviral expressing, hopefully to find a new solution to the treatment of hard-healing wounds， and to lay a foundation for vessel tissue engineering.

脂肪干细胞是治疗难愈创面理想的内皮种子细胞，因其分化程度难以控制影响了临床应用，究其原因是分化机制不明。已有资料表明外泌体对干细胞分化调控起着重要的作用，提示外泌体在脂肪干细胞向内皮分化中可能起着关键作用。申请人发现：EPO处理的脂肪干细胞的外泌体可促进脂肪干细胞向内皮分化，外泌体的miRNA芯片及生物信息学分析提示miR-152在脂肪干细胞向内皮分化过程中具有重要作用；进一步生物信息学分析及标靶验证均证实EphrinB2是miR-152的标靶之一。为此，本研究将以EPO脂肪干细胞向内皮分化作为研究模型，采用miRNA技术、慢病毒表达、下肢缺血模型、激光散斑成像等等技术，从分子水平、细胞水平及体内创伤修复等多个层次研究外泌体中miR-152介导靶基因EphrinB2调控脂肪干细胞向内皮分化的机制，为研发干细胞治疗难愈创面提供新的思路和药物靶标，也为血管组织工程种子细胞构建提供研究基础。

背景：将内皮细胞输送至缺血组织，通过血管生成来恢复器官功能的方式正在成为损伤组织血运重建的替代方法。脂肪源性干细胞(ASCs)是一种容易获取的间充质干细胞来源，具有快速增殖和多分化潜能。有观点认为，由脂肪源性干细胞分化而来的内皮细胞(ECs)是再生医学中成人血管修复和通过组织工程方法血管构建的未来方向。方法：本研究在缺氧条件下，联合应用血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白-4(BMP4)诱导人脂肪源性干细胞(hASCs)向血管内皮细胞谱系分化。通过免疫荧光染色、实时PCR和免疫印迹试验分析测定CD31、血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）和血管内皮细胞钙粘连蛋白（VE-cadherin）的表达。这些分化细胞获得成熟内皮细胞的功能性表征，在体外通过其成管能力、DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）摄取和一氧化氮分泌进行测定。通过亚硫酸氢盐测序确定近端启动子CpG的甲基化状态。结果：缺氧条件下，VEGF和BMP4联合处理的人脂肪源性干细胞表达包括CD31、VEGF-R2、VE-cadherin在内的内皮细胞标志物。这些分化细胞在体外表现出血管生成潜能，注射这些分化细胞可增强糖尿病小鼠缺血后肢的血管生成。此外，研究发现缺氧显著增加EphrinB2表达的内皮细胞分化，而EphrinB2阻断可显著下调向内皮细胞分化效率。近端启动子CpG甲基化状态结果显示，缺氧暴露的人脂肪源性干细胞中EphrinB2启动子甲基化下降。结论：在低氧条件下，介导靶基因ephrinB2去甲基化介导人脂肪源性干细胞可以被有效地诱导分化为血管内皮细胞。