从Cx43半通道探讨补肾强督法对强直性脊柱炎抑制骨化和改善骨质疏松作用的机制研究

Both ossification and osteoprosis were exsisted in ankylosing spondylitis(AS).The effect of Connexin 43 (Cx43) hemichannel on osteoblast differentiation is important，that has two-ways regulations on pathologic bone formation .Cx43 is a gap junction (GJ) protein widely expressed in osteoblasts and fibroblasts.Jiao shu de is argued that AS is caused by kidney and Du Channel yang insufficiency. Tonifying the kidney and reinforcing DU channel has a good clinical effect.Not only blood ESR and CRP were decreased in AS patients after treated by Busheng Qiangdu herb，but also immobility of joints were reliefed.The experimental research results show that tonifying the kidney can regulatory phenotype of fibroblasts and enhancement proliferation osteoblasts,but it's mechanism of action was unknow.Thus,we study mechanism on Cx43 hemmichannel of fibroblasts and osteoblasts vitro cultured from bi-transgenic rats of HLA-B27 and β2 microglobulin rats .And then,we study the mechanism of tonifying the kidney to strengthen Du channel on prevention and treatment of ossification and osteoporosis by CX43 protein ，MAPK access protein and Ca2+.

强直性脊柱炎（AS）病理性骨形成包括附着点成纤维细胞成骨过度和骨干成骨细胞成骨不足。研究表明Cx43蛋白是构成成纤维细胞、成骨细胞半通道的主要成分，Cx43半通道在成骨细胞的增殖和分化等信号传导中起着重要的作用，对骨质变化具有双向调节功能。焦树德教授集几十年临床经验，提出了补肾强督治疗大法，该法临床应用多年，大量的临床和实验证明补肾强督法治疗AS疗效肯定，不仅可以有效缓解关节僵硬，改善骨化程度，同时还能增加骨密度，缓解骨质疏松。但其作用机制尚不明确。本研究通过采用HLA-B27及β2微球蛋白双转基因动物模型，以附着点以及骨干为研究对象，从整体动物模型以及体外细胞培养研究Cx43半通道对AS病理性成骨的调控靶标的作用。在此基础上以Cx43半通道为靶点，通过观察影响半通道功能的Cx43蛋白、MAPK通路蛋白、Ca2+的表达，探讨补肾强督法对AS附着点过度骨化以及骨干骨质疏松的调控作用及其机制。

强直性脊柱炎（AS）是侵犯脊柱关节的慢性炎症性疾病，持续的病理性骨形成是AS致残的重要因素。AS病因未明，大量研究显示Cx43缝隙蛋白在AS异位骨化和骨干骨质疏松中起重要作用。课题基础表明以补肾强督治偻方为主的补肾强督法治疗AS疗效确切，并且Cx43可能是其对病理性成骨双向调节作用的重要靶点，但具体机制不明。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）、显微注射法、PCR、ELISA和Western Blotting法等多种分子生物学手段，开展体内外研究。结果显示：（1）补肾强督治偻方水提液质量稳定，并可下调IFN-γ极化的RAW264.7细胞的TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表达水平；(2)成功构建HLA-B27/β-2m双转基因大鼠模型，动物实验结果显示:模型组大鼠脾脏指数（SI）显著降低，关节炎指数显著增高，而经过补肾强督治偻方水提液干预30天后，关节炎评分显著降低，ALP表达水平降低。阳性药西乐葆组胸腺指数（TI）较对照组显著下调，关节炎评分显著下降（P＜0.05）;中药组成骨细胞Cx43蛋白阳性成骨细胞明显增多。结果共同提示补肾强督治偻方对Cx43介导的成骨分化环节起重要作用。（3）补肾强督治偻方水提液干预对hBMP -2诱导的成纤维细胞使Cx43蛋白及Cbfa1蛋白表达水平显著减少（P<0.05）；（4）DEX刺激的成骨细胞pCx43、Runx2蛋白表达下调，而补肾强督治偻方水提液干预经DEX刺激的成骨细胞可显著促进pCx43、Runx2蛋白表达。上述结果证实了我们提出的“补肾强督治偻方对附着点的成纤维细胞产生抑制成骨作用和对骨干内的成骨细胞产生促进成骨作用，以纠正AS的附着点骨化和缓解骨干骨质疏松”的假说，揭示补肾强督治偻方通过不同靶细胞调控Cx43蛋白的机制。补肾强督治偻方对AS病理性成骨的“双向调节”的作用，为阐明补肾强督法治疗AS异位骨化和骨干骨质疏松提供一个新靶点和新思路，同时也丰富了中医药治疗强直性脊柱炎的科学内涵。