基于金属标记结合生物质谱的蛋白质组相对和绝对定量新方法研究

Based on metal labelling and Liquid chromatography-mass spectrometry technique, new methods will be established for the relative and absolute quantitation of proteomes and for the verification of target proteins in complicate biological samples. In creating the method, suitable bifunctionalagents and metal elements will be first selected for metal labelling with high efficiency, the influence of pH on the labelling processes be examinated, the sequence for the addition of metal chelates and peptides for metal labeling be optimized, the retention behavior of metal labelling peptides mixture in the chromatographic process and the signal response as well as cleavage behavior in mass spectrometry analysis be carefully observed. The optimum experimental conditions will be made by optimizing each step of the method,and then the accuracy,sensitivity, dynamic range and reproducibility of this method will be determined. Finally, the method is applied for the research of the differential protein analyses of liver cancer cells.Through the comprehensive analyses, differential proteins will be found, and the verification of target proteins is performed and their absolute quantity in the cell lines is determined. This information will be provided for pathology studies, diagnosis and treatment of the human hepatopathy. In addition, a new perspective avenue for the proteomic quantitayive methods will be opened.

建立一种适用于复杂生物体系中蛋白质组相对和绝对定量分析、蛋白目标验证的新方法，即基于金属鳌合物化学修饰结合液－质联用蛋白质组定量方法。通过选用标准蛋白质对该方法中所用双功能试剂和质量标签所用金属元素的选择、标记过程中pH的影响、金属鳌合物形成与多肽标记的先后顺序、金属标记多肽混合物在色谱分离时的保留行为以及在质谱分析过程中质谱行为的考察，分别建立蛋白质组的相对和绝对定量方法，并对方法的每个关键步骤进行优化，确定出方法应用时的最佳实验条件，并考察所建方法的准确度、灵敏度、动态范围和重现性。在此基础上，将该方法用于高低转移肝癌细胞的差异蛋白质分析。通过对实验结果进行综合分析，寻找差异蛋白质，并对差异蛋白质进行目标验证，并检测其绝对含量，为人类肝病病理研究、诊断和治疗提供依据，同时为定量蛋白质组学的方法学研究提供一种新的研究思路。

目前定量蛋白质组学研究中常用的定量方法主要采用稳定同位素标记结合液质联用技术，其中的稳定同位素试剂合成困难、价格高，用量多，导致实验成本的显著升高且选择范围窄。为了解决基于同位素试剂化学标记方法存在的这类问题，我们提出了新的研究思路、开发出新的标记方法及相应的蛋白质组定量技术，以满足以液质联用方法为核心的蛋白质组学技术用于解决生物学研究、疾病诊断、治疗和生理病理研究中的需要。. 按课题计划书要求，我们发展了基于金属标记结合色谱-质谱的蛋白质组定量方法。首先考察了金属标记效率、金属标记的稳定性、标记后肽段的色谱保留和质谱行为、新定量方法的线性范围和准确度，实验结果表明金属标记具有标记效率高、稳定性好、色谱保留行为一致等优点。在此基础上我们建立了一种金属元素标记结合质谱用于蛋白质N-末端肽段的鉴定及相对定量新方法，使原本不能被质谱鉴定的短序列N-末端肽能够鉴定；建立了一种金属标记结合多反应监测质谱绝对定量蛋白质的新方法，以及一种金属标记结合高效液相色谱-选择性离子监测质谱的蛋白质绝对定量新方法，为比较简单的生物样本中蛋白质或蛋白质组的绝对定量方法提供了一种新的选择。另外，还发展了18O/金属等重标记结合质谱蛋白质组绝对定量新方法，首次将双重等重标记与MRM质谱技术相结合用于目标蛋白质的绝对定量，提高了定量的准确性；进一步发展了一种18O标记QconCAT结合液质联用的目标蛋白质组绝对定量方法，用于生物样品中目标蛋白质组较高通量的定量验证和确认；针对18O同位素标记回标影响定量结果准确度的问题，我们提出了一种通过增大酶量的蛋白样本快速、高效酶切方法，并对人肝微粒体中的重要药物代谢酶进行了定量；针对基体干扰和制作工作曲线中存在的问题，建立了一种新的计算内源分析物浓度的方法。在蛋白质鉴定和定量的前处理技术方面，我们制备并评价了三种固定化酶反应器；发展了一种超灵敏的基于纳米金和氧化石墨烯的3G-ELISA方法；研制了一种多通道毛细管色谱柱装填装置和一种简单的毛细管色谱柱电加热装置；研制了一种微量制备型凝胶电泳装置；发展了多种基于金属离子和氧化石墨烯的富集及鉴定磷酸肽和糖肽的方法。. 在课题实施中，共发表标注本基金研究论文18篇，其中SCI收录11篇；申请国家发明专利6项，其中3项已被授权；参与编写论著1本；培养博士4名，硕士10名。