基于成骨转录因子Osterix基因为靶点的跨膜人工锌指肽分子设计及在成骨/破骨平衡中的作用

Osterix（OSX）是一种具有3个C2H2锌指基序的转录因子，为成骨细胞分化和骨形成所必需，因此以OSX基因作为药物靶基因具有广泛的应用前景。本项目基于前期工作基础，分析OSX基因序列，设计能与OSX基因启动子区18bp序列结合的6个锌指基序，位点选择性亲和凝胶电泳筛选亲和性最好的锌指蛋白，将人工合成的锌指蛋白融合到核心结合因子（Cbfa1）的DNA功能结构域区 (位于第236-363之间氨基酸序列)，再在合成的转录因子N-末端加上一段促进人工转录因子跨膜的HIV TAT蛋白穿膜肽。将构建的人工转录蛋白克隆到相应真核表达载体在真核细胞进行表达，抽提纯化活性蛋白，观察活性蛋白穿膜效果及促进骨髓间充质干细胞和成骨细胞内OSX基因表达程度。并在此基础上，探讨该人工锌指肽分子对成骨/破骨平衡的可能机制。本课题的开展，旨在为开发新的骨质疏松症及退行性骨病治疗的新型大分子药物提供有力依据。

Osx是成骨特异性转录因子，其表达水平在成骨过程中起到关键性的作用。本课题基于成骨基因osx设计人工转录因子，并验证人工转录因子在细胞生物学、分子生物学、成骨染色以及动物整体方面的效果。截至目前，本课题已完成除动物整体实验以外的其他的部分。设计的人工转录因子包括细胞穿膜肽、锌指多肽、功能域、核定位信号及flag标签。将其翻译成核苷酸序列后插入到慢病毒载体中，转染成骨细胞mc3t3-e1后检测人工转录因子在细胞水平的成骨效果。Real-time PCR结果显示人工转录因子、osx及成骨基因Runx2、ALP、OCN等表达均上调，Western blot分析显示osx表达上调，EMSA结果显示人工转录因子与osx启动子能够特异性结合。ALP染色也显示细胞ALP活性增加。.以上部分投稿SCI杂志biochemical and biophysical research communications被拒，投稿international journal of molecular medicine后也被拒。意见是建议补充双荧光素酶实验及成骨基因Western blot分析。目前实验尚在进行中。