棉铃虫P450异源表达体系优化及代谢抗性相关基因的RNAi沉默研究

在前期工作基础上，本项目拟继续优化抗性棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7的异源表达体系，在毕赤酵母中异源共表达CYP6B7、细胞色素b5和P450还原酶基因，并对异源共表达体系的培养条件进行优化，以得到对不同菊酯类农药有更佳催化活性的P450重组体系，为进一步研究利用P450工程菌降解环境中残留农药或其它环境有毒污染物奠定基础。. 鉴于P450酶系在棉铃虫对菊酯类农药代谢抗性中的重要作用，本项目还将利用RNA干扰技术，通过体外转录与棉铃虫代谢抗性相关的细胞色素P450、P450还原酶（CPR）及细胞色素b5基因的dsRNA，研究比较三种基因dsRNA单独或联合作用于棉铃虫后对基因的沉默效果，基因沉默后棉铃虫对不同药剂的敏感性变化、微粒体P450对不同菊酯类农药的降解情况等，以期发现能够有效降低或抑制棉铃虫抗药性的RNAi沉默技术体系，为研制新型有效的棉铃虫抗药性治理措施奠定基础。

通过RT-PCR和RACE技术克隆得到了敏感及抗氰戊菊酯棉铃虫幼虫中肠的细胞色素P450还原酶（CPR）及细胞色素b5还原酶（CBR）基因，分析了CPR和CBR基因的序列特征和时空表达情况，并预测了其结构和功能，为表达载体构建以及深入研究细胞色素P450酶系不同组分与棉铃虫抗药性关系奠定了基础。. 分别构建了细胞色素P450 CYP6B7及P450还原酶基因的重组表达载体CPR-pPICZA、CYP6B7-pPICZA以及CYP6B7-CPR-pPICZA，并导入毕赤酵母菌内，通过甲醇诱导异源表达；SDS-PAGE蛋白电泳、利用添加的His标签进行Western Blot、以及CO差光谱扫描均证明CYP6B7和CPR蛋白在毕赤酵母菌中成功表达。优化了异源表达体系的培养条件。随后的农药降解实验表明，转基因酵母菌株的表达产物对2种菊酯类农药（联苯菊酯、氰戊菊酯）和1种有机磷农药（毒死蜱）有明显的降解作用。这些研究为以后利用P450重组体系降解环境中残留农药或其它有毒污染物奠定了基础。. 筛选得到了能够触发明显的抗性棉铃虫基因沉默效应的dsRNA片段（如dsCYP6B7-313，dsCPR-403）（注射法）；dsCYP6B7-313、dsCPR-403及dsCyt-b5介导的基因沉默在12-48hr内存在时间效应关系；dsCYP6B7-313单一注射或与dsCPR-403、dsCyt-b5联合处理均能使CYP6B7 mRNA表达量显著下降，而且三者联合处理后引起的抑制作用总体最明显；由dsRNA引起的CYP6B7、CPR及Cyt-b5基因表达沉默，能够增强抗性棉铃虫对氰戊菊酯、高效氯氰菊酯的敏感性，使药剂的毒力明显提高，而且氰戊菊酯和高效氯氰菊酯对三种dsRNA联合作用过的棉铃虫幼虫的毒力亦最高。此外，喂食法导入的dsRNA也能触发抗性棉铃虫CYP6B7、CPR及Cyt-b5基因的RNAi沉默效应。以上研究，首次将RNAi技术应用于菊酯类药剂抗性棉铃虫的P450s不同组分基因的功能鉴定，进一步证明了CYP6B7在棉铃虫对菊酯类药剂的抗药性形成中的重要作用，而且明确了CYP6B7、CPR和Cyt-b5共同参与棉铃虫对菊酯类药剂的抗药性。通过RNAi技术，使棉铃虫对药剂敏感性提高，从而使药剂毒力增强，本项工作为研究棉铃虫抗药性治理新措施提供了思路。