抗氰戊菊酯棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因过量表达调控机制研究

Based on the results of previous studies, the regulation mechanisms of cytochrome P450 CYP6B7 gene in resistant population of cotton bollworm will be investigated. Genome walking technique will be used to clone the 5’-flanking regulatory region of CYP6B7 gene, and regulatory elements related to fenvalerate resistance will be identified. Transcription factors binding to regulatory elements will be identified by yeast one-hybrid method, and functionaly confirmed by plasmid co-transfection and gene silencing techniques. Moreover, comparison of the difference in regulatory elements of CYP6B7 gene between resistant and susceptible population of cotton bollworm will be carried out, and relationship between regulatory elements of CYP6B7 gene and resistance of cotton bollworm will be analysed. The results will help to elucidate the molecular mechanisms underlying resistance development in cotton bollworm, and provide important basis for working out efficient measures to prevent or control the resistance of cotton bollworm.

在前期研究的基础上，本项目拟深入研究与棉铃虫抗药性相关的细胞色素P450 CYP6B7基因过量表达的调控机制。通过基因组步移法克隆CYP6B7基因5’端调控区序列，寻找与氰戊菊酯抗药性相关的调控元件，并采用酵母单杂交法鉴定与调控元件结合的转录因子，通过转录因子和CYP6B7基因启动子的共转染和基因沉默技术，分析验证转录因子的功能；同时比较抗性和敏感棉铃虫CYP6B7基因表达调控因子的差异，分析调控因子和棉铃虫抗药性之间的关系。研究结果将有助于阐明棉铃虫抗药性产生和发展的内在分子机制，为研究制定棉铃虫抗药性预防和治理策略奠定基础。

细胞色素P450 CYP6B7过量表达是棉铃虫对菊酯类杀虫剂产生抗性的重要原因，其表达调控机制有待阐明。项目克隆得到敏感和抗氰戊菊酯种群棉铃虫CYP6B7基因启动子序列。通过构建5’片段缺失重组质粒，检测双荧光素酶活性，并进行缺失和突变比较分析，鉴定出HDS和HDTJ种群棉铃虫CYP6B7启动子中氰戊菊酯顺式作用元件分别位于-528 bp到-486 bp、以及-84 bp到-55 bp之间。利用酵母单杂交技术筛选得到33个可能和氰戊菊酯顺式作用元件结合的候选转录因子，并通过RNAi沉默相应基因、转录因子与启动子共转染后活性检测等方法进行功能验证，确定多个候选转录因子能够和顺式作用元件结合，参与调控氰戊菊酯对棉铃虫CYP6B7基因的诱导过量表达。.分别构建敏感（HDTJ）和抗性（HDTJFR）种群棉铃虫CYP6B7启动子重组质粒HDTJ-p（-1484/-1）和HDTJFR-p（-1484/-1），并检测氰戊菊酯对重组质粒活性的影响，发现HDTJFR-p（-1484/-1）的基础活性和氰戊菊酯诱导活性均显著高于HDTJ-p（-1484/-1）。而且与HDTJ种群相比，HDTJFR种群CYP6B7启动子序列有7个碱基发生突变，这些突变位点包含转录因子Cf2，Ubx/Otp，Zen2，Abd-B/Dbx和Ara/Br的结合位点；将抗性种群这7个位点的碱基分别突变成敏感种群对应的碱基，构建突变重组质粒并检测活性，发现和HDTJFR-p (-1484/-1)相比，包含Ubx/Otp，Zen2和Ara/Br结合位点的碱基突变后，其突变重组质粒活性显著降低，说明上述结合位点可能是HDTJFR种群CYP6B7启动子中氰戊菊酯的响应区，并可能在该种群对氰戊菊酯抗性中起重要作用。此外，HDTJFR种群棉铃虫Ubx和Br基因表达量显著高于HDTJ种群，表明Ubx和Br与棉铃虫对氰戊菊酯抗性密切相关。通过RNAi沉默Ubx和Br基因，会显著抑制CYP6B7的表达量，并使氰戊菊酯处理的HDTJ和HDTJFR种群棉铃虫死亡率增加，且抗性种群死亡率增加更显著；而且还使其他抗性相关P450基因表达水平被显著抑制；表明Ubx和Br除了调控CYP6B7的表达，还参与其他P450基因的表达调控，从而介导棉铃虫对氰戊菊酯的抗药性。项目研究结果进一步阐明了棉铃虫对氰戊菊酯产生抗性的内在分子调控机制。