弓形虫毒力基因ROP18缺失株的构建及特性研究

弓形虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病。弓形虫棒状体蛋白ROP18参与宿主细胞的侵入过程，表达量高低决定其毒力强弱，是弓形虫最主要的毒力因子。为了获得弓形虫毒力基因ROP18缺失株，阐明相应虫株的生物学和免疫学特性，本研究拟以HXGPRT基因打靶载体转染弓形虫RH株滋养体，通过抗性筛选和核酸鉴定获得弓形虫HXGPRT缺失株。运用常规分子生物学技术克隆弓形虫ROP18基因及其侧翼序列，以CAT、HXGPRT为正、负选择标记，构建ROP18基因打靶载体，转染弓形虫RH株HXGPRT缺失株，经正、负抗性筛选及核酸杂交等鉴定，获得弓形虫毒力基因ROP18缺失株。鉴定和分析弓形虫毒力基因ROP18缺失株的生物学特性（感染细胞病变特征、散播速率、生长特性及对小鼠、犬、猫等动物的病原性）和免疫学特性（在小鼠、犬、猫等动物的抗原性及免疫保护效率），为弓形虫毒力基因缺失株的疫苗应用奠定基础。

弓形虫病是由弓形虫引起的一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。弓形虫病迄今仍然没有理想的治疗药物，由于弓形虫感染后可引起宿主保护性免疫应答，因此研制安全、有效的疫苗应是弓形虫病较好的防治对策。弓形虫疫苗的研制经历了全虫疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸（或DNA）疫苗等几个阶段。目前仍然没有一种安全、有效的弓形虫疫苗。近年来人们对弓形虫毒力相关因子有了较为深入的研究，为弓形虫毒力基因缺失疫苗的研制奠定了基础。弓形虫通过速殖子不断入侵宿主细胞,并溶解破坏细胞,导致严重疾病。速殖子的顶端有复杂的细胞结构和分泌细胞器，包含微线体(microneme)、棒状体(rhoptry)和致密颗粒(dense granule)，它们在入侵细胞和导致机体感染的过程中起重要作用，与弓形虫毒力强弱密切相关。微线体蛋白（MIC）首先分泌，在识别和黏附宿主细胞中起作用，棒状体随后释放内容物（ROP），参与纳虫泡形成，最后致密颗粒蛋白(dense granule protein，GRA)分泌入纳虫泡，参与纳虫泡膜网络形成。. ROP18是由棒状体分泌的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，I型弓形虫（强毒株）ROP18的表达量远远高于III型弓形虫(无毒株)，III型弓形虫ROP18表达量增加，虫株毒力也随之增强，主要表现弓形虫在宿主体内快速散播、高虫荷量及Th1细胞因子的过量表达。因此，棒状体蛋白ROP18表达量的高低决定了弓形虫毒力的强弱，ROP18是弓形虫最主要的毒力因子。. 通过HXGPRT基因打靶载体转染弓形虫RH株滋养体，通过抗性筛选和核酸鉴定获得弓形虫HXGPRT缺失株；运用常规分子生物学技术克隆弓形虫ROP18基因及其侧翼序列，以CAT、HXGPRT为正、负选择标记，构建ROP18基因打靶载体，转染弓形虫RH株HXGPRT缺失株，经正、负抗性筛选及核酸杂交等鉴定，获得弓形虫毒力基因ROP18缺失株。通过免疫荧光分析，表明弓形虫ROP18缺失株的粘附能力下降，而ROP18缺失株的侵入能力无显著变化，毒力试验表明，弓形虫ROP18缺失株毒力明显下降。