基因打靶弓形虫GRA12缺失株的构建及生物学和免疫学特性研究

Toxoplasmosis is a zoonotic parasitic disease caused by T. gondii. There is no safe and effective vaccine against toxoplasmosis. Due to the sophisticated immunological evasion mechanisms of the parasite, the development of an effiecious vaccine have been proven to be highly challenging. The dense granule protein12 (GRA12) is a recently discovered dense granule protein，we have found that GRA12 DNA vaccine can induce protective immunity in mice.However, there is no reports about the specific founction of GRA12 protein, and no research about the biological and immunological characteristics. This research will use gene targeting technique to construct HXGPRT gene targeting vector containing the GRA12 flanking sequences to knockout GRA12 by homologous recombination in Toxoplasma gondii. Recombinant GRA12-/- mutants of Toxoplasma will be screened and selected using CAT as a positive and HXGPRT as a negative selection marker. The resultant mutants will be determined the function in intravocule network (by analyzed for the expression level and location of GRA 1-9 indirectly), also the biological characteristics(cell lesions, spreading rate, growth characteristics and pathogenicity in host animals ) and the immunological characteristics(antigenicity and the ability to induce protective immunity). This research will facilitate to the study of genetic founction and the development of vaccines against toxoplasmosis using gene targeting technologies.

弓形虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，迄今没有安全有效的疫苗。弓形虫GRA12 是一种新发现的致密颗粒蛋白，申请者先前研究发现GRA12蛋白能诱导小鼠产生免疫保护，但对GRA12蛋白的具体功能、生物学和免疫学特性国内外尚没有相关研究报道。本研究拟运用基因打靶技术构建HXGPRT基因打靶载体，克隆弓形虫GRA12基因及两侧翼序列，通过同源重组技术，以CAT、HXGPRT为正、负选择标记，筛选弓形虫毒力基因GRA12缺失株，鉴定和分析GRA12缺失株对弓形虫纳虫空泡网络调节作用 （对GRA1-9表达水平的调控、在纳虫空泡中位置迁移的影响）、生物学特性（细胞病变、散播速率、生长特性及对实验动物的病原性）和免疫学特性（抗原性、诱导免疫保护效率），为弓形虫基因组功能研究和毒力基因缺失疫苗研究奠定基础。

弓形虫病是一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。人们通过生食感染了弓形虫的肉或被弓形虫卵囊污染的水或食物而感染本病。由于弓形虫病会导致孕畜流产、死产、胎儿畸形等症状，不仅危害人类的健康，也给畜牧业造成严重的经济损失。由于药物的毒副作用和机体的抗药性，目前弓形虫病没有有效的治疗措施，寻找有效的弓形虫疫苗候选抗原，对于人类健康和畜牧业生产具有重要意义。. 致密颗粒蛋白（GRAs）作为弓形虫的主要排泄分泌抗原成分，不仅在诱导宿主产生保护性免疫应答方面起重要作用，而且修饰纳虫泡膜结构，参与纳虫泡膜网络形成, 保护虫体在细胞内的存活与增殖。GRA12 是新发现的一种参与纳虫空泡内膜网络调节的致密颗粒蛋白，分子量为44kDa，与其他GRA 蛋白无同源性，对GRA12蛋白的具体功能、生物学和免疫学特性尚不清楚。. 本研究首先利用基因打靶技术构建弓形虫GRA12缺失株，并对其相关特性进行研究，具体内容包括以下几个方面：.1. 弓形虫GRA12缺失载体的构建. 利用PCR技术从弓形虫基因组上扩增GRA12基因5'非编码区片段和3'非编码区片段，将其分别克隆入pminCAT/HXGPRT+载体质粒中，经序列测定分析，两侧翼片段长1825bp和1871bp，与Genebank上发表的弓形虫基因组的同源性为100%。酶切鉴定表明成功构建了pminCAT/HXGPRT-GRA12-UTR质粒。.2.弓形虫GRA12缺失株的筛选及鉴定. 将成功构建的pminCAT/HXGPRT-GRA12-UTR质粒经线性化，电穿孔技术转染导入弓形虫内，同源重组整合入弓形虫基因组，抗性筛选GRA12缺失的阳性克隆株。经PCR扩增和Southern blotting杂交进行鉴定，成功筛选弓形虫GRA12缺失株。.3. 弓形虫GRA12缺失株特性的研究. 通过对弓形虫GRA12缺失株的生物学和免疫学特性研究发现：弓形虫GRA12缺失株对宿主细胞的粘附能力降低，体外增殖数量减少，对小鼠的毒性减弱。通过对纳虫空泡内网络调节相关基因研究发现：GRA12基因缺失对弓形虫GRA2、GRA6、GRA7基因的表呈正调控作用。本研究为弓形虫基因缺失疫苗研究奠定基础。