弓形虫酪蛋白激酶CK1对细胞周期的调控

Toxoplasmiasis, caused by the protozoan Toxoplasma gondii, is one of the important zoonotic diseases, which have seriously affected human health, food safety and animal production in the world. However, there is still no ideal control strategy against the disease. Casein kinase 1 (CK1) belong to a conserved family of serine/threonine protein kinases that plays an important and diverse role in vesicular trafficking, DNA repair, cell cycle progression and cytokinesis in organisms from yeast to humans. In multicellular organisms CK1 enzymes also regulate developmental pathways, control circadian rhythms and have been implicated in Alzheimer's disease progression. T. gondii encodes two CK1 isoforms, whose functions are still unknown. In this study, we will determine the expression characteristics of T. gondii CK1α and CK1β, and construct CK1α- and CK1β-deficient strains. By comparison of transcriptome sequencing and phosphorylated proteins of CK1α- and CK1β-deficient strains and wild type strain GT1, we will determine cell cycle regulation and mechanisms of T. gondii by CK1α- and CK1β, which will provide foundation for development of gene deletion vaccine and drug targeting CK1 for T. gondii.

弓形虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，严重危害人类健康、食品安全和畜牧业生产，目前仍无理想的防治方法。酪蛋白激酶（CK）是一类保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，参与囊泡转运、DNA修复、细胞周期和细胞分裂等生命过程。弓形虫编码CK1α和CK1β基因，其功能还未见报道。我们通过敲除弓形虫CK1α，发现其与虫体细胞周期相关，但其作用机制尚不清楚。本研究拟在前期研究结果基础上，确定弓形虫CK1α和和CK1β的表达特性；构建弓形虫CK1α和CK1β缺失株，通过CK1α和CK1β缺失株与野生株转录组测序及差异磷酸化蛋白的比较，确定弓形虫CK1α和CK1β对细胞周期的调控及机制，为弓形虫基因缺失疫苗及CK1靶向药物研制奠定基础。

弓形虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，严重危害人类健康、食品安全和畜牧业生产，目前无理想防治方法。酪蛋白激酶（CK）是一类保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，参与囊泡转运、DNA修复、细胞周期和细胞分裂等生命过程。.利用RT-PCR 技术扩增CK1α编码序列，构建原核表达载体 pET-28a-TgCK1α，经 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析，重组蛋白 CK1α分子量为 38 kDa，运用 IFA 检测 CK1α主要在弓形虫细胞质表达。利用 PCR 方法克隆弓形虫 CK1α侧翼序列，构建基因打靶载体，电穿孔转染弓形虫，筛选初步获得弓形虫 CK1α缺失株，再用探针技术、Southern blotting 、 Westernblotting 进一步鉴定确证弓形虫 CK1α缺失株。.以弓形虫cDNA为模版扩增弓形虫CK1β编码序列，获得目的基因为1299bp，构建表达载体pET-22b-CK1β，重组蛋白经SDS-PAGE、Western blotting检测分子量为 49 kDa。利用IFA检测CK1β主要在弓形虫细胞膜表达。利用 PCR 技术扩增TgCK1β非编码序列，构建弓形虫 CK1β 基因打靶载体，转染、筛选获得弓形虫 CK1β缺失株，再经 PCR 及 Southtern blot 方法鉴定。弓形虫生物学特性研究结果表明，CK1α缺失株增殖速度较野生株慢（P＜0.05），证明CK1α的表达影响弓形虫增殖。流式细胞术检测细胞周期差异，结果 CK1α缺失株 S 期高于野生株，经统计分析差异显著（P＜0.05），说明 CK1α缺失导致细胞周期阻滞在 S 期影响虫体增殖，CK1α是弓形虫增殖的调控基因。黏附、侵入与毒力试验表明，CK1α缺失株的黏附、侵入能力及致病力与野生株差异不显著（P＞0.05）。本研究为鉴定弓形虫病药物治疗靶点奠定基础。