TLR4通路在原发性胆汁性肝硬化上皮-间质转化中的诱导作用及分子机制研究

原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种自身免疫病，最终发展为肝纤维化、肝硬化，病因未知。已经明确，PBC中TLR4通路异常，但异常TLR4通路在PBC发展中的作用尚不清楚。我们在前期研究中初步发现TLR4通路活化可诱导肝内胆管细胞（IBEC）显著增殖，推测可能与其发生上皮-间质转化（EMT）有关，IBEC的EMT在PBC进展中意义重大。为进一步确证，我们拟在本研究中探讨异常的TLR4信号通路（包括MyD88依赖和非依赖途径）对IBEC细胞EMT的诱导作用及具体机制，及其与PBC发生和进展的关系。我们将从组织、细胞和分子水平，应用免疫组化（包括单染和双染）、基因过表达、基因沉默、生物信息学技术、荧光素酶报告技术、EMSA等多种技术，采用逐一验证的方式，从正反两方面阐明在PBC发生发展过程中异常TLR4通路诱导IBEC细胞EMT的机制及关键信号分子，为寻找有效阻断PBC进展的重要靶点提供有力借鉴。

我们按计划圆满完成预期目标，基本取得预期结果。具体如下：一、免疫组化研究证实，PBC患者肝内胆管上皮细胞TLR4和波形蛋白表达明显增高，E-钙粘蛋白明显降低，而且随着PBC纤维化严重程度的加重而更明显，TLR4的表达与E-钙粘蛋白成反比，波形蛋白成正比。提示在PBC向纤维化发展中会出现肝内胆管上皮细胞EMT现象，而TLR4与EMT密切相关。二、通过细胞实验证实，在肝内胆管上皮细胞中LPS-TLR4通路活化后，主要通过MyD88依赖的方式诱导肝内胆管上皮细胞EMT，P38-AP1途径在其中起关键作用，AP1最终通过活化转录因子Snail启动肝内胆管上皮细胞EMT。这些结果已经整理成英文文章，拟投SCI杂志。通过上述研究，基本阐明了TLR4通路诱导肝内胆管上皮细胞EMT的分子机制，为有效控制PBC发展提供了潜在靶点。此外，在研究过程中，根据实际情况拓展了一些研究内容，并取得重要结果。在收集PBC患者肝组织标本及临床资料过程中，发现联合检测血清自身抗体会提高PBC诊断效能。这样，有利于我们更准确收集标本，排除误诊标本对研究结果的影响。同时，还通过循证方法，证实泌尿道感染是PBC的独立危险因素，泌尿道感染主要是由革兰阴性菌引起的，其主要成分LPS，进一步提示TLR4通路在PBC中异常活化的原因。我们在追踪PBC研究进展时发现目前对于PBC是否是肝癌的独立危险因素尚存在争议，因此，进行了一个大规模的循证研究，结果证实PBC确实是肝癌发生的一个独立危险因素。这样通过完整的临床、循证和基础实验研究，我们大体可以初步找出这样一个线索：泌尿道感染——LPS——TLR4通路异常活化——PBC发生发展——肝硬化——肝癌。这些大量扎实的数据、结果，为我们能够有信心沿着这一方向进行进一步的深入探讨奠定了坚实基础。在本项目资助下，我们发表SCI论文6篇，单篇最高影响因子12.003分。资助的论文受邀参加2013风湿免疫病实验诊断技术全国培训大会，作为VIP作大会报告； 2013全国检验医学大会，获得优秀论文奖； 2011上海市检验医学大会，获得申威基金优秀论文一等奖。本课题培养博士、硕士各1名，均已毕业。其中博士研究生利用本课题获得第二军医大学博士创新基金和校特等奖学金和校长奖学金。硕士研究生获校奖学金一等奖，并继续攻读博士学位。