尿液外泌体内miR-214调控PI3K/Akt通路对肾脏衰老过程的作用机制研究

Kidney is one of the fastest aging organs. With renal aging, urine exosomes are changing. But it is not clear about the renal aging and microRNA in urine exosomes. The applicant previous studies suggest miR-214 in urine exosome is associated with kidney aging. Through the bioinformatics prediction and forecast experiment, the applicant proposes that miR-214 could negatively regulate target genes (such as Pten) to cause renal aging. For this project, in vitro, we will use renal tubular cell line to study the mechanism of miR-214 in urine exosome and its target genes in PI3K/Akt signal pathway to renal fibrosis; in vivo, the renal aging rat model is using to find the function of miR-214 and PI3K/Akt pathway to renal fibrosis. It will lay the foundation of the study of renal aging.

肾脏是衰老最快的器官之一，随着肾脏衰老进展尿液外泌体内物质也发生改变，但尿液外泌体中miRNAs与肾脏衰老之间关系却不明确。申请人前期研究结果提示尿液外泌体中miR-214与肾脏衰老有关。通过生物信息学预测和预实验，申请人提出外泌体中miR-214负调控Pten等下游靶基因引起肾脏衰老。本课题体外实验方面将在细胞系中分析外泌体中miR-214对肾小管上皮细胞功能影响并明确miR-214与PI3K/AKT信号通路之间的关系；体内实验方面利用肾脏衰老大鼠模型明确miR-214对肾脏纤维化的影响以及PI3K/Akt通路在其中起到的作用。最终阐明尿液外泌体中miR-214影响肾脏衰老的作用机制以及miR-214与PI3K/Akt在肾脏衰老过程中的分子机制，为尿外泌体中miRNAs对肾脏衰老的作用研究奠定基础。

衰老是人类生命过程的必然规律，衰老的特征是生理完整的渐进性丧失，进而导致各器官的功能受损和个体易死性增加。肾脏是人体衰老较快的组织之一，但肾脏衰老进展过程中遗传物质和miRNAs对肾脏纤维化的作用机制仍在探索中。在本研究中，首先，研究者提取不同年龄阶段人群中的尿液外泌体，利用miRNA芯片明确了miR-214与肾脏衰老有关，之后扩大各年龄段人群数量，并重新提取尿液外泌体中的miRNAs，再次验证了miR-214与肾脏衰老、eGFR之间正相关。其次，在HK-2肾小管细胞系中敲低或过表达miR-214、miR-150-5p、miR-34b后发现这三种miRNAs，尤其是miR-214可抑制肾小管细胞进行肾小管-间质转化（EMT），且提示miR-214过表达后可减缓肾小管上皮细胞的老化程度，说明miR-214可能具有抗衰老作用。同时，我们构建过表达hsa-miR-214的人肾小管上皮细胞株，提取此细胞株细胞上清内的外泌体，并将其转染入正常HK-2细胞中，结果提示过表达hsa-miR-214的细胞上清外泌体也可以减缓肾小管上皮细胞的老化程度，但对HK-2肾小管上皮细胞的增殖无影响。接着，我们利用荧光素酶报告基因等实验明确了miR-214可负调控Pten。并利用D-半聚糖肾脏衰老大鼠模型，提取其肾脏组织，并检测miR-214的表达，发现miR-214含量较正常大鼠无显著增加，且PTEN的表达无明显变化。最终结果提示尿液外泌体中miR-214作用为预防肾小管上皮细胞进行EMT，当肾脏衰老过程发生时miR-214的分泌增多，从而被外泌体包裹并运送至肾小管上皮细胞中，并通过对PTEN等的表达调控来抑制肾脏纤维化的过程，本研究为尿外泌体中miR-214对抗肾脏衰老的作用研究奠定基础。