双组分信号转导系统ArcA/ArcB调控副猪嗜血杆菌致病性的分子机制研究

Haemophilus porcine is one of the most important bacterial blight that endangering the pig industry. The two component system ArcA/ArcB is very important for the survival and pathogenesis of pathogenic bacteria. In this study, the arcA deficient mutant (ΔarcA) and arcB deficient mutant (ΔarcB) of the H. parasuis serovar 13 clinical strain EP3 were constructed respectively, and we investigated the serial of biological characteristics of mutants, such as doubling time, virulence, serum resistance, biofilm formation and stress reaction. Furthermore, the comparative transcriptomics and comparative proteomics analysis was performed between the EP3 and mutant strains in order to clarify the correlation between ArcA/ArcB and the survival and pathogenicity of Haemophilus influenzae, and elucidate the function and regulation mechanism of TCS ArcA/ArcB in Haemophilus Haemophilus, which is significant for revealing the pathogenic mechanism of Haemophilus Haemophilus, preventing the disease and developing vaccine.

副猪嗜血杆菌病是危害养猪业的重要细菌性疫病之一。双组分系统ArcA/B对病原菌生存与致病至关重要，经研究证明，副猪嗜血杆菌15个血清型都有保守的arcA、arcB基因，双组分系统ArcA/B是否调控副猪嗜血杆菌的生存与致病性，有待揭示。本项目以副猪嗜血杆菌野毒株EP3为出发菌株，分别构建ArcA、ArcB敲除株和互补株；研究野毒株和敲除株在生长、毒力、血清抗性、生物膜和应激反应等相关生物学性状差异；运用RNA-Seq高通量测序技术对野毒株和敲除株基因的转录差异进行分析；利用iTRAQ蛋白定量技术比较敲除株与野生株全菌蛋白表达谱的差异。通过两种组学的分析，找出相关毒力蛋白基因，并对其进行敲除，以分析验证其功能，揭示双组份信号转导系统ArcA/ArcB调控副猪嗜血杆菌致病的分子机制，为阐明副猪嗜血杆菌致病机理提供理论基础，可为该病的防治以及疫苗研制提供理论依据。

副猪嗜血杆菌可导致猪多发性浆膜炎、脑膜炎、败血症等症状，病死率高。双组分系统ArcA/ArcB与细菌的代谢和毒力密切相关。本项目从四个方面进行了研究。1.克隆表达了arcA、arcB基因，融合蛋白经纯化后免疫小鼠，获得相应的抗体。用“自杀质粒”通过自然转化方法，构建了副猪嗜血杆菌ΔarcA、ΔarB缺失株及其恢复菌株。2.通过生长特性、血清抗性、自凝集、生物膜和动物毒力等方面的研究，发现arcA、arcB基因与细菌生长特性、毒力等特性密切相关。3.运用RNA-seq技术对副猪嗜血杆菌野毒株和基因敲除株进行比较转录组学的研究。发现与arcA基因密切相关的有73个基因，其中57个基因转录升高，16个基因转录下降。发现与arcB基因密切相关的有677基因，上调基因371个，下调基因306个；差异基因主要影响糖代谢、转录翻译因子、脂类代谢、氨基酸代谢、核酸代谢和毒力等，表明这些差异基因主要涉及副猪嗜血杆菌的能量代谢和细胞膜的合成等过程。4.运用iTRAQ技术对副猪嗜血杆菌野毒株和基因敲除株进行比较蛋白组的研究，发现与ArcA密切相关的有119个显著差异蛋白。54个蛋白表达上调，65个蛋白是表达下调。与ArcB基因密切相关的有512个蛋白，上调238，下调274。差异蛋白主要影响三羧酸循环、磷酸肌醇代谢、二羧酸代谢 、鞘脂类代谢、β-丙氨酸代谢、磷酸戊糖途径、丙酸代谢、谷胱甘肽代谢、NAD代谢、过氧化氢酶体、嘌呤代谢、次生代谢物的合成、氮代谢、糖酵解、果糖和甘露糖代谢、半乳糖的代谢、淀粉和蔗糖代谢、泛酸的生物合成和其它多糖降解途径等。为进一步解释ΔarcA、ΔarB缺失株生物学特性变化的原因并为研究副猪嗜杆菌致病机制提供帮助。