石山苣苔属花器官形态分化和物种适应性进化的分子机制研究

Selecting species of bilateral-radial flower lineage in Petrocodon as materials (four species and one variety), we will probe into the molecular mechanism of floral morphological differentiation species adaptive evolutionary under extreme Karst geographic and topographic condition. The species in the bilateral-radial flower lineage specifically distributed in the limestone areas of southwestern China are characteristic of extreme range of floral morphological variation co-evolved with the change of insect pollination model. We first employ real-time PCR and in situ hybridization methods to conduct comparative expression pattern analyses of the specific controlling factors of the these floral morphological characters, i.e. PCYCs and their possible targets PRAD and PcyclinD3a/b, in the representative species of this lineage, aiming at understanding correlation of the floral variation and related gene expression. Then, we will further carry out a series of specific transgenic functional studies of PCYCs and related genes. Furthermore, this project will search and detect the binding site of PCYC proteins in the 5' upstream regulatory region of PCYC's possible targets PRAD and PcyclinD3a/b and further conduct a series of protein-DNA interaction analyses, including Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSAs) in vitro and Chromatin immunoprecipitation (ChIP) in vivo, aiming to detect the possible molecular changes in the regulatory network of PCYCs and their targets. This project aims to reveal the molecular evolutionary mechanism underlying the floral morphological variation and the adaptive species differentiation of the bilateral-radial flower lineage in Petrocodon under the extreme Karst geographic and topographic condition.

本项目首先开展控制这些花部形态性状的CYC类PCYC及其相关目标基因PRAD和PcyclinD3a/b以及腹特性PDIV基因表达模式的比较研究，分析表达模式的时空分化和这些形态变异的相关关系以及它们在调控关系上可能发生的变化；然后，通过对PCYC及其相关基因的特异转基因功能分析试图发现它们在蛋白质和启动子可能的功能变化同表达模式与形态分化的相关关系和作用途径，并进一步经蛋白-DNA结合作用分析PCYC基因对其目标基因PRAD和PcyclinD3a/b调控过程中可能发生的变化所产生的形态变异及其作用机制。经全面的综合分析，本项目以期揭示石山苣苔属两侧-辐射对称花分支花器官形态变异和物种适应性分化过程中花对称性主控基因PCYC及其目标基因的分子进化机制。该项目研究结果对进一步理解适应性物种形成与进化具有重要的理论意义。

本项目计划通过传粉生物学观察、CYC类及其相关基因表达模式的时空分化和形态变异的相关关系的分析、相关基因的特异转基因功能分析，以期揭示石山苣苔属两侧-辐射对称花分支花器官形态变异和物种适应性分化的形态-分子进化机制。基于rDNA ITS和5个cpDNA片段(atpI-atpH, matK, trnH-psbA, rps16, trnL-F)，我们开展了石山苣苔属全面的系统发育重建和分子钟估测。研究结果显示石山苣苔属具有6个支系。各支系内的花形态分化十分显著，整个属展示出花形态的巨大多样化。石山苣苔属从第一次分化到第6个支系的形成仅经历3.44百万年，说明该属是一个十分年轻的快速分化类群，并集中体现在花形态的分化和多样化。然而，石山苣苔属的花形态分化和物种多样性在各支系之间非常不均衡。支系A仅有5种，但花形态分化十分巨大。支系E既展示出花形态的较大分化，也表现出一定的物种多样性。支系F具有巨大的物种多样性，物种数目几乎占整个属的一半。然而，该支系多数种类的花形态只是在较小范围内发生频繁分化，基本形态十分相似。传粉生物学观察显示两侧-辐射对称花分支均为蜂类传粉，从两侧到辐射对称花，传粉行为则发生与之相关的变化，具有密切的传粉行为-花形态的协同进化。在另一个分支，我们发现随着花形态的演化，传粉媒介则发生了从蜂类经过鸟类到极其罕见的昆虫幼虫传粉的巨大变化，具有密切而又独特的传粉者-花形态的协同进化。石山苣苔属两侧-辐射对称花分支的花形态变异与CYC类基因表达模式的变化密切相关。然而，另一分支花型突变和传粉者均发生巨大变化的协同进化和CYC类基因活动并没有直接关系。我们通过启动子截短分析确定了CYC类基因的最短功能启动子。CYC类基因的表达在时间上可以分为三个模块：花原基中的表达，花器官原基发生时期的表达和花器官发育时期的表达。我们在被子植物中首次报道CYC类基因控制花的朝向。该项目研究结果对进一步理解适应性物种形成与进化具有重要的理论意义。