石蝴蝶属植物适应性快速分化的分子进化机制研究

Selecting representative species of different clades in Petrocosmea (Gesneriaceae) as materials, we will probe into molecular evolutionary mechanisms underlying the species adaptive rapid differentiation under specific geographic background of Hengduan Mountains. The species of Petrocosmea specifically distributed in the Himalaya-Hengduan mountain areas are characteristic of dorsal-specific floral morphological variation co-evolved with the change of insect pollination model. We will first conduct whole transcriptomic sequencing and digital gene expression (DGE) with RNA-seq technology to identify the specific controlling genes of the dorsal petals, and carry out artificial interspecific hybridization with allele specific expression (ASE) analyses in F1 to understand the genetic differentiation of the identified genes between clades. Then, we will further carry out a series of functional studies of the upstream promoter of the identified genes, including a series of deletion analyses, substitution mutagenesis analyses and transgenic gain-of-function and functional complement analyses of the detected cis-regulatory elements related to gene specific transcription and function in repressing petal development. Furthermore, this project will conduct selection tests both in coding and regulatory sequences including related cis-elements and association analyses of molecular-phenotypic evolution. This project aims to reveal the molecular evolutionary mechanism underlying the dorsal-specific floral morphological variation and the adaptive species differentiation and diversification in Petrocosmea under the specific geographic background of Hengduan Mountain regions.

本项目针对石蝴蝶属花器官尤其背部花瓣的形态变异及其多样性开展横断山区独特地理条件下物种适应性快速分化的分子进化机制研究。 本项目首先开展转录组测序和数字基因表达谱分析，结合候选基因研究结果，确定特异性控制背部花瓣的关键调控因子。经过人工杂交试验和F1代等位基因特异性表达分析了解这些相关基因在支系间的遗传分化途径并开展相关实验验证；尤其通过对相关基因上游启动子一系列转基因功能分析，试图发现决定这些基因背特性功能和控制背部花瓣生长的顺式调控元件；并进一步开展蛋白-DNA与蛋白-蛋白结合作用实验分析他们之间的调控与互作关系及其对形态变异的作用机制。经过对相关基因分子进化模式与分子-表型进化关联分析以及全面综合分析，本项目以期揭示横断山脉地区独特地理条件下石蝴蝶属植物以背部花瓣形态变异为特征的物种适应性快速分化的分子进化机制。该项目研究结果对深入理解适应性物种形成与进化具有重要理论意义。

针对在喜马拉雅-青藏高原迅速隆升和横断山区独特地理条件下石蝴蝶属植物花器官，尤其背部花瓣的形态变异及其多样性，我们开展了该属植物适应性快速分化的分子进化机制的系统研究。转录组分析确定了特异性控制该属植物背部花瓣的5个关键调控因子，即：TCP家族的CYC1C、CYC1D和CIN1、NAC家族的NAC100和WIP家族的NTT。通过大量人工杂交实验，我们在F1代开展了一系列等位基因特异性表达分析，发现了十分奇特的遗传现象和分子进化新的机制，如越亲表型、反向进化、高度冗余基因截然不同的分子调控机制、ABC模型中B和C类基因产物的剂量平衡以及顺式调控变化所产生的剂量失衡等。在拟南芥的过表达功能验证显示CYC1C、CYC1D和NAC100在功能上可能主要抑制背部花瓣生长，NTT和CIN1则可能参与对局部细胞生长的抑制，和花瓣的反折和卷叠有直接关系。转基因GUS报告基因分析显示CYC类基因的启动子具有控制背部和侧部器官的特异性功能。我们发现并在功能上验证了一系列直接调控CpCYC的转录因子及其结合元件。酵母双杂和双分子荧光互补的蛋白-蛋白、凝胶电泳迁移和双荧光素酶报告基因的蛋白-DNA互作分析显示CYC类基因可能直接或通过激活NAC100调控花瓣大小。CYC类基因和NAC100通过激活NTT，和CIN1构成拮抗关系，控制花瓣形状。在大岩桐中，我们首次在被子植物中报道了花朝向的控制基因和CYC类基因作用的多效性。通过RNA干涉，我们在斑叶草中揭示了CpCYC对两侧对称花形态建成的功能和主控作用。5个关键基因编码区和调控区的分子进化模式分析进一步显示自然选择对这些基因的编码区并没有产生明显效应，而是作用于其调控区，从而产生背部花瓣在支系间的形态分化。上述系统性研究全面揭示了在喜马拉雅-青藏高原迅速隆升背景下石蝴蝶属植物以背部花瓣形态变异及其多样性为特征的物种适应性快速分化的分子进化机制。