mTOR/S6K1正调节细胞自噬的机理研究

Generally, mTOR/S6K1 is believed to be the negative regulator of autophagy. .Nevertheless, we are bothered that, under many circumstances, autophagy .can be enhanced accompanied by the activation of either mTOR/S6K1 .or/and AKT signaling. In these settings, people usually considered the .autophagy was mTOR-independent. Thus, the main topic of the present .study is to investigate the possibility and the mechanism of autophagy .positively regulated by mTOR/S6K1. Base on our former studies and .preliminary results, and by using electro-microscopy, confocal microscopy, .small RNA interference, immunoblotting et al, we will carry out following .examination: (1) if mTOR/S6K1 positively regulate autophagy via .negative feedback mediation of AKT; (2) if EGFR and its downstream .adaptor proteins are involved in this process; (3) the role of AMPK and .GSK3 signaling in autophagy positively regulated by mTOR/S6K1. .Though those experiments, we intend to clarify the machinery in .which mTOR/S6K1 has a positively regulatory role in mediation of .autophagic process and have a better understanding about the .regulation of autophagy through crosstalk between different .signaling pathways.

通常认为mTOR/S6K1是自噬的负调节因子。在近年来的研究过程中，一直困扰着我们的问题就是，在很多情况下，自噬的增加往往伴随着mTOR/S6K1和/或AKT信号的激活，尽管多数研究者将其归于mTOR非依赖的细胞自噬,而是否存在着mTOR/S6K1正调节自噬以及通过什么样的机制目前还不清楚。因此，在前期研究和已取得的初步结果的基础上，我们将用电镜、激光共聚焦显微镜、RNA干扰、免疫杂交等手段，拟开展以下研究工作：（1）mTOR/S6K1正调节自噬是否是通过负反馈调节AKT信号；（2）mTOR/S6K1正调节自噬与EGFR内吞以及其下游插头蛋白（Grb2，Grb10，Shc,Cbl等）间的关系；（3）mTOR/S6K1正调节自噬是否通过影响AMPK、GSK3等信号来实现。通过上述研究能确定mTOR/S6K1正调节自噬的机理，以期能更好地认识不同信号间的相互串扰对细胞自噬的调节作用。

细胞自噬受多种信号通路的调节，其中在哺乳类细胞中研究比较多的是mTOR/S6K1(P70S6K)，通常认为mTOR/S6K1是自噬的负调节因子，但在近年来的研究中发现，在很多情况下，自噬的增加往往伴随着mTOR/S6K1和/或AKT信号的激活，尽管多数研究者将其归于mTOR非依赖的细胞自噬，而是否存在着mTOR/S6K1正调节自噬以及通过什么样的机制调控自噬目前还不清楚。因此，我们开展了mTOR/S6K1正调节自噬的相关机制研究。我们发现在肾癌细胞中，真菌来源的次生代谢产物rasfonin通过上调Akt的磷酸化促进细胞自噬，证明了Akt在调节细胞自噬过程中可以发挥正向作用。敲降Akt或加入Akt抑制剂能降低rasfonin诱导的自噬和caspase依赖的凋亡。同时，Akt抑制剂会降低rasfonin引起的PFKFB3的转录及翻译水平的增加。而促进Akt的活性可以增强rasfonin的细胞毒作用；Akt能够调节同源重组修复过程中关键蛋白Rad51的表达，敲降Rad51抑制了rasfonin诱导的细胞自噬，说明DNA损伤修复对细胞自噬具有调控作用；糖酵解限速酶PFKFB3即可以定位于细胞质，也可以定位于细胞核，其可以通过AMPK和AKT信号通路来调节自噬，且其调节自噬的作用与其亚细胞定位有关；AKT和PFKFB3可以互为上下游，协调发挥作用；在研究过程中我们还发现AKT/mTOR信号可以调节与凋亡相关蛋白的表达；免疫沉淀结果表明，mTOR与之存在着直接的相互作用，而共同干扰两者可以恢复由于敲降AKT/mTOR所导致受抑制的细胞自噬，这可能是mTOR信号通路正调节自噬的内在机制。综上，我们的研究进一步揭示了自噬的调节机制和自噬与糖酵解及自噬与细胞核损伤间的关系。