噬菌体介导的CRISPR-Cas系统消除动物源黏菌素耐药病原菌的研究

The discovery of MCR-1, a new mechanism of plasmid-mediated colistin resistance, has led to the risk of few clinical medicines against Gram-negative infectious diseases. The CRISPR-Cas system could specifically identify and eliminate resistance genes in pathogens to sensitize or kill resistant pathogens. In our previous study, the sgRNA sequence targeting the mcr-1 gene was synthesized and tested for activity by in vitro transcription and enzyme digestion reaction. We initially found that the CRISPR-Cas system targeting the mcr-1 gene could be used to sensitize plasmid-mediated colistin-resistant pathogens. In this study, we will design knockout target targeting mcr-1 gene according to its important structural and functional domains, and then construct phage-transferable CRISPR-Cas9 systems through the construction of sgRNA/Cas9 and transformation of T7 phage. Finally, the clearance effects on colistin resistant pathogens carrying mcr-1 gene of the system will be verified by using in vitro clinical strains and in vivo target animals (pig and chicken)experiments. Our study firstly applies λ bacteriophage as the vector of the CRISPR-Cas9 system targeting mcr-1 gene to sensitize plasmid-mediated resistant pathogens, which has significant implications for mitigation and control the spread of colistin resistance.

质粒介导的黏菌素耐药新机制MCR-1的发现可导致临床对革兰氏阴性菌感染面临无药可用的风险。CRISPR-Cas系统可特异性识别和清除病原菌中的耐药基因，敏化或杀灭耐药病原菌。我们前期合成靶向mcr-1基因的sgRNA序列，进行体外转录活性检测及体外酶切反应，初步发现可通过建立针对mcr-1基因的CRISPR-Cas系统用于敏化质粒介导的黏菌素耐药菌。本申请课题针对mcr-1基因编码蛋白质的重要结构功能域设计敲除靶点，通过sgRNA/Cas9构建、T7噬菌体改造等建立噬菌体介导的CRISPR-Cas9系统，并运用体外临床菌株及体内靶动物(猪、鸡)实验验证该系统清除病原菌中mcr-1基因的效果。本课题是国内外首次采用λ噬菌体作为载体，建立新型特异性识别含有mcr-1基因病原菌的CRISPR-Cas9系统，敏化mcr-1基因介导的黏菌素耐药菌株，对减缓和控制黏菌素耐药性的传播具有重要意义。

细菌耐药性已成为当前亟需解决的全球性重大公共卫生问题。CRISPR-Cas9系统是细菌的一种获得性免疫系统，能够抵御各种外源核酸的入侵，可被开发为防控细菌耐药性的新技术。因此，本研究对动物源大肠杆菌进行流行病学调查，并利用CRISPR-Cas9技术来特异性识别和清除病原菌中的耐药基因，从基因水平消除耐药菌。.本研究成功分离571株动物源大肠杆菌，药敏结果显示这些大肠杆菌对美罗培南、黏菌素耐药率较低，分别为3.2%、4.9%，且耐药株均表现为多重耐药。选取mcr-1、blaNDM-5和mecA基因为靶标，结果显示，质粒介导的CRISPR-Cas9系统能高效特异性消除靶标耐药质粒或杀灭耐药菌。对于mcr-1质粒，6 h即可达到50%消除效率，8 h达到80%消除效率；对于blaNDM-5质粒，2 h即可达到50%消除效率，16 h达到80%消除效率；且质粒消除前后细菌对黏菌素和美罗培南的最小抑菌浓度分别降低8和266倍。当串联两个mcr-1的靶点时，消除效率提高了2个Log10值；同时串联mcr-1和blaNDM-5的靶点时，可以达到一步消除两种耐药质粒的目的。同时，接合抑制实验表明CRISPR-Cas9系统能保护细菌免受耐药质粒的再次入侵，说明CRISPR-Cas9系统具有免疫记忆的功能。以mecA基因为靶标时，与对照组相比，实验组在18h的菌量降低约4个Log10值，说明靶向染色体时可达到直接杀灭耐药菌的目的。.基于CRISPR-Cas9反筛选技术，成功构建重组噬菌体λGFPuv和λCRISPR-Cas9。对溶原菌进行基因型和表型验证，结果表明，外源基因GFPuv和CmR在原噬菌体状态下成功插入和表达。与原菌相比，溶原菌的化转子降低2个Log10值，说明溶原菌中整合的CRISPR-Cas9系统能发挥特异性靶向消除功能。将上述溶原菌中的λCRISPR-Cas9诱导，并进行靶向消除实验。结果显示，与对照组比较，实验组荧光强度显著下降，重组噬菌体12 h的溶原效率仅10%，但已溶原的细菌中约99%的耐药质粒已被靶向消除，说明噬菌体递送的CRISPR-Cas9系统能高效特异性靶向消除耐药质粒。.综上所述，CRISPR-Cas9系统能从基因水平消除耐药菌，不仅能使耐药菌恢复对抗生素的敏感性，还能阻断耐药质粒的水平转移，对减缓和控制细菌耐药性的传播具有重要意义。