狭叶香蒲重金属转运蛋白HMA（Heavy Metal ATPase）类基因的分离鉴定及功能分析

Typha is a perennial herbaceous plant, and has good application in the water purification for their heavy metal resistance and large growth. In addition, Typha angustifolia is a famous aquatic vegetable in the area of middle and lower reaches of Yangze River, named Pucai. Previous studies has showed that HMA (Heavy Metal ATPase) are transmembrane metal-transporting proteins that play a key role in metal homeostasis, uptake and accumulation. However, the number and functions of these genes in T. angustifolia are still unknown. In this study, we identify HMA genes in response to heavy metal (Pb) stress in T. angustifolia through de novo trascriptome data analyses and establish the regulation networks of HMA genes by gene co-expression analysis. At the same time, we will study the temporal and spatial expression pattern of TyHMA genes under Pb stresses. In addition, we will clone the TyHMA1 as a breakthrough point to invesetigate the functions and molecular mechanism of HMA genes using Co-Immunoprecipitation (Co-IP), yeast two-hybrid (Y2H), bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and so on. Our results will facilitate our understanding the molecular mechanism of TyHMAs and provide a basis for utilizing the heavy metal tolerant gene with application value in T. angustifolia.

香蒲是一类对重金属有极强的耐受性，生长量大的多年水生宿根草本植物。除可用于净化水体之外，狭叶香蒲（Typha angustifolia）也是我国长江中下游常见的水生蔬菜，蒲菜。已有研究表明，重金属转运蛋白HMA是介导重金属离子吸收、转运与区隔过程的关键转运蛋白，但该类基因在狭叶香蒲中的功能及数目尚不清楚。本项目在前期对淮安狭叶香蒲进行Pb胁迫处理前后不同组织中无参转录组的分析基础上，挖掘狭叶香蒲响应重金属胁迫的HMA类基因，通过基因共表达分析，建立共表达网络；研究狭叶香蒲不同组织中的HMA类基因在不同浓度不同时间的Pb胁迫下的时空表达；克隆分析TyHMA1，通过转基因技术、免疫共沉淀、酵母双杂、BIFC等技术研究该基因在狭叶香蒲中重金属吸收、累积及转运基因调控功能机制。这些研究结果将为理解狭叶香蒲HMA类基因应答重金属胁迫分子机制，并利用香蒲中具有重要价值的耐重金属基因提供依据。

随着工农业发展，环境中土壤重金属污染程度日益严重。重金属污染干扰植物体水分吸收、离子转运、细胞代谢等正常生理生化过程，严重制约蔬菜品质和产量。香蒲（Typha angustifolia）是淮安等地重要的水生蔬菜，因其重金属耐受性及庞大的生长量，也是重要的净化水体植物。.为解析香蒲重金属累积特性，本项目首先完成了香蒲全长转录组测序，共获得19002个基因并注释，12052个SSR标记和392个lncRNA，为香蒲基因的挖掘、功能研究和转录调控研究提供资源；基于香蒲全长转录本数据库，分离并克隆获得6个HMA家族基因，其中3个基因（TyHMA3、TyHMA5和TyHMA7）在根中表达量较高，另外3个则在叶中表达量较高，并根据转录组数据构建共表达网络；联合部分高等植物和低等植物中的HMA基因进行系统进化分析，明确HMA基因的分组特征并阐明各分组间的进化历程；亚细胞定位分析表明TyHMA5、TyHMA6和TyHMA7在细胞质膜上表达，应属于转运蛋白；重金属胁迫下，香蒲HMA基因的表达发生明显分化，TyHMA5和TyHMA7在Cu2+处理下显著上调表达，TyHMA3则在Cd2+和Pb2+处理下，在根组织中迅速响应，表达显著高于地上部组织，进一步证实TyHMA3参与Cd2+和Pb2+在香蒲根中的累积；由于香蒲遗传转化技术体系建立较困难，在模式植物烟草和拟南芥中通过遗传转化证实TyHMA3基因降低了重金属胁迫下对植物产生的氧化胁迫伤害，进而增强植株对Cd和Pd的耐受性；蛋白互作试验初步证实TyHMA3和其他重金属转运相关蛋白（CCS、NRAMP和MTPA）协同参与重金属胁迫作用，从而降低或者清除Pb和Cd的毒害效应。本研究初步解析香蒲HMA基因的功能，为揭示香蒲对重金属的耐受性机理及改良蔬菜种质创新提供重要理论依据。