灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶基因内含子的结构与调节功能研究

真核生物基因非编码序列结构及调控机制的研究是当今生物学研究的新领域，植物病源真菌内含子调控基因表达的知识还鲜为人知。利用已得到的灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺(IPC)合成酶基因(AUR1)缺失内含子的突变株，测定AUR1的 mRNA表达量和IPC合成酶活力，确认内含子对AUR1表达的影响。构建缺失不同内含子序列的表达载体，转化灰葡萄孢菌，检测mRNA和IPC合成酶的表达量，筛选影响基因表达显著的内含子序列。生物信息学预测该序列中的调控元件，构建缺失调控元件和调控元件点突变表达载体，转化灰葡萄孢菌，检测mRNA和IPC合成酶活力，确定调控元件的序列和调控功能。在短梗霉素A存在和缺乏情况下，观察不同表达载体转化的灰葡萄孢菌的细胞形态，测定草酸和神经酰胺的量、纤维素和果胶酶活力，以及对果实感染的影响，明确内含子序列及其调控元件对细胞表型和致病力的影响，为鞘脂合成关键酶的调控研究奠定基础。

近年许多研究表明真核生物基因内含子具有调控基因表达的作用，内含子结构与功能的研究引起了研究者的极大关注。灰葡萄孢菌AUR1基因(BcAUR1)对细胞的生长和发育起重要作用，目前关于BcAUR1基因中内含子对其基因表达的调控尚未见报道。. 我们的研究发现和证实：（1）在灰葡萄孢菌AUR1基因缺失内含子突变株中，BcAUR1基因的cDNA序列与野生型相同，表明突变株抵抗AbA是由于BcAUR1基因缺失内含子所致，而不是氨基酸突变所致。（2）突变株的BcAUR1基因在转录和翻译水平均呈现高表达，表明该内含子序列对BcAUR1基因表达起调控作用。（3）通过构建缺失不同内含子序列的表达载体，转化灰葡萄孢菌，检测转化子BcAUR1基因表达。结果表明：BcAUR1基因缺失 127-154内含子序列的BcAUR1△1能降低BcAUR1基因的mRNA和IPC合成酶表达，推测该内含子序列可能是BcAUR1基因表达的顺式作用元件。BcAUR1基因缺失127-168内含子序列的BcAUR1△4能显著增强BcAUR1基因mRNA表达，表明该内含子序列是抑制BcAUR1基因的转录的元件。由此推断内含子155-168位的核苷酸序列TCGCTCTCTTTGAG可能是调控AUR1基因表达的元件，起转录抑制子的作用。（4）与阳性对照相比，BcAUR1Δ1的细胞生长、草酸分泌、纤维素酶和木聚糖酶活力均受到抑制，这可能是由于BcAUR1基因缺失 127-154内含子序列，导致了细胞生长受抑制，并降低了其致病性。（5）与阳性对照相比，BcAUR1Δ4的细胞能在高浓度的AbA的培养基上生长，能感染AbA处理的番茄。这表明BcAUR1Δ4细胞产生了对AbA的抗性。推测BcAUR1基因中127-168内含子序列能增强BcAUR1转录，导致BcAUR1Δ4细胞抵抗AbA对IPC合成酶的抑制作用。（6）BcAUR1Δ4在不含AbA和含有AbA时，其孢子萌发速度和芽管伸长明显快于野生型和阳性对照。BcAUR1Δ 4 的细胞形态不同于野生型和阳性对照；BcAUR1Δ 4菌丝细而长，分支少，多个孢子囊聚集成卵圆球状。BcAUR1Δ 4抵抗AbA对细胞生长的抑制，可能与BcAUR1基因缺失内含子序列4增强AUR1基因表达相关。（7）BcAUR1Δ4抑制与致病相关的草酸分泌和水解酶活力，促进与防御相关的SOD酶活力。