磷脂酰肌醇合成酶的结构与功能

Phosphatidylinositol and its derivatives are important lipid molecules found in all kingdom of lives. Phosphatidylinositol phosphates mediates a broad range of signal transduction processes in mammals and plants. The glycosylated species of phosphatidylinositol are the major and essential lipids for mycobacteria, which include the highly infectious pathogen Mycobacterium tuberculosis. PgsA3, predicted to cross membrane 4 times, is an essential enzyme responsible for phosphatidylinositol synthesis, a fact that suggests PgsA3 is a potential drug target in controlling the threatening pathogen. PgsA3 shares 40% similarity with the human homologue, hPIS. Both enzymes use CDP-diacylglycerol as the phosphatidyl-donor, but have different preferences for inositol substrates in catalysis. hPIS uses inositol but PgsA3 uses the monophosphate form. The structural mechanism for the functional differences is not known. But yet, the structure mechanism can aid rational drug design for PgsA3-specific inhibitors that does not affect the human counterpart. This project proposes to solve the three dimensional structure of PgsA3 and hPIS in lipid bilayer environment using X-ray crystallography. Biochemical characterization will be carried out to test the structure-based hypothesis as how the enzyme works at the molecular level. Structure biology approaches will be used also to reveal the structural mechanism of the substrate preferences of the two enzymes. The detailed structural differences should provide rational guidance in designing narrow-spectrum antibiotics against the mycobacterium phosphatidylinositol synthase.

磷脂酰肌醇及其衍生物是广泛分布于生物界的重要脂质，其磷酸化形式介导高等生物细胞信号转导，而其糖基化形式则是病原结核杆菌细胞膜的主要和必要组成部分。结核杆菌的磷脂酰肌醇合成酶PgsA3预测跨膜4次，是该病原菌生长所必需的功能蛋白，因而是重要的药物靶标。PgsA3与人类同源酶hPIS在序列上存在40%相似性，且使用相同脂质底物二磷酸胞苷-甘油二酯（CDP-DAG）作为脂酰基供体，但在亲水底物选择上分别使用磷酸肌醇和肌醇作为脂酰基受体，存在区别。造成该底物选择差异的结构原因尚不清楚。而基于结构差异，设计小分子抑制PgsA3而不影响人类同源酶活性，是研发抗生素新药的有效途径。本项目拟采用X-射线晶体结构生物学手段，测定PgsA3及hPIS在脂双层环境的空间结构，并结合生化分析，阐明二者的催化分子机制。同时，揭示它们功能活性存在细微区别的结构依据，为基于结构差异而设计特异药物提供理论基础与精准模型。

作为细胞膜的主要组分，磷脂是所有生物细胞生存所必需的。磷脂的生物合成第一步是甘油3-磷酸的酰基化。在几乎所有的细菌中，这一步由一个7次跨膜蛋白PlsY催化，将酰基磷酸上的酰基转移到甘油3-磷酸，生成溶血磷酯酸。在许多病原菌中，对编码PlsY的基因进行敲除导致细菌死亡，因而它是一个抗生素的新型靶点。PlsY的酰基供体目前仅在细菌中发现，而且PlsY也是目前唯一一个被报道能利用其作为供体的酶（其它酰基转移酶都用酰基辅酶A或载酰蛋白作为供体）。我们对PlsY蛋白进行了纯化和结晶，解析了它的超高分辨率结构至1.48埃，结果显示PlsY跨膜7次，纠正了文献中的错误认识。PlsY的结构与任何已知结构没有同源性或者同源结构域，说明其结构是一个全新的折叠模式。PlsY的结构是利用在LCP脂立方相（一种凝胶状的非天然脂双层环境）中获得的晶体所解析的。为了证明我们解析的是功能相关的构象，以及在LCP中仍然有催化活性，我们发明了一种在LCP中快速、灵敏、方便的酶学检测方法。该方法利用PlsY反应中释放磷酸的特点，将产生的无机磷酸偶联到一个结合蛋白上导致后者荧光增强。通过这一方法我们获得了PlsY在LCP中的米氏常数，也证明了PlsY在LCP中是具有活性的。我们还获得了PlsY与两个底物、两个产物的共结晶结构，清楚地揭示了酶的活性中心组成和装配细节，并据此推断传统的Asp-His转酰基机制不适合PlsY。通过上述的生化活性检测方法以及理性设计的突变体，我们验证了这一推断。我们继而提出一个新型的转酰基机制：底物协助催化。在这个机制中，催化过程不需要具体的氨基酸的参与，酶的作用是将底物固定成特定距离和角度，利于底物间相互活化和自催化。我们获得的结构还阐明了底物进入活性中心和产物从活性中心释放的路径和机制。此外，其产物溶血磷酯酸是酶的抑制剂，我们的结构也阐明了其发生酶活抑制的机制。对这些结构进行比较发现，PlsY基本维持了一个相对稳定的构象，说明其具有一个相对刚性的活性中心，这为今后针对该蛋白质进行小分子设计的工作提供了直观的三维模型。