革兰氏阴性菌溶血磷脂转运体LplT与酰基-酰基载体蛋白合成酶Aas结构与功能研究

Lysophospholipids are important intermediate products of bacterial biosynthesis. Lysophospholipid transporter (LplT) was previously found to be primarily involved in the transport of 2-acyl lysophosphatidylethanolamine (lyso-PE), a lysophospholipid, which recycles in gram-negative bacteria. LplT imports lyso-PE from the periplasmic leaflet into the cytoplasmic leaflet. The imported lyso-PE is subsequently reacylated by a peripheral enzyme, acyl-acyl carrier protein synthetase (Aas), using the acyl-acyl carrier protein as the acyl donor to regenerate PE on the inner leaflet of the membrane. This work will reveal the potential role of LplT and Aas in maintaining the membrane stability and integrity in Escherichia coli envelope. Recently, it has been reported that LplT and Aas contribute to the resistance against host cell phospholipase A2. This finding renders it important for us to understand the mechanism of the transportation and recycling of lysophospholipid. I have published two membrane protein complex structural and functional studies in Nature and Nature Communication as co-first author in 2016 and 2017, and have gained plenty of experience in the structural and functional studies of membrane protein. We plan to clarify the lysophospholipid transport and recycle mechanism by determining the structure of LplT and Aas using crystallography and performing functional studies based on their structure. We will have a better understanding of how lysophospholipid is transported and recycled to maintain the cell envelope and resist host cell attacks.

溶血磷脂是细菌生存代谢过程中所产生的重要的中间体。膜蛋白LplT翻转转运体将所产生的溶血磷脂转运入细胞质，膜蛋白酰基-酰基载体蛋白合成酶Aas将这些溶血磷脂再利用并生成新的磷脂分子供细胞生长与代谢。最近的研究发现，LplT-Aas溶血磷脂转运并再利用系统除了维持自身代谢平衡以外，对于细菌抵抗宿主细胞磷脂酶A2亦然有重要意义，细菌需要清除由A2磷脂酶攻击细菌细胞膜时所产生的溶血磷脂。因此对于LplT-Aas系统的研究可以提升我们对于细菌膜系统重塑过程的理解，还可以揭示细菌侵蚀宿主细胞时所展现的特有的抵抗力的机制。项目申请者曾在2016和2017以共同第一作者身份分别在Nature和Nature Communication杂志中发表过膜蛋白复合体晶体与功能研究成果，我们主要希望通过结构生物学的手段，解析LplT和Aas的蛋白结构，然后推测溶血磷脂的转运再利用机制和细菌膜系统完整性维持机制。

溶血磷脂是细菌生存代谢过程中所产生的重要的中间体。膜蛋白LplT翻转转运体将所产生的溶血磷脂转运入细胞质，膜蛋白酰基-酰基载体蛋白合成酶Aas将这些溶血磷脂再利用并生成新的磷脂分子供细胞生长与代谢。最近的研究发现，LplT-Aas溶血磷脂转运并再利用系统除了维持自身代谢平衡以外，对于细菌抵抗宿主细胞磷脂酶A2亦然有重要意义，细菌需要清除由A2磷脂酶攻击细菌细胞膜时所产生的溶血磷脂。因此对于LplT-Aas系统的研究可以提升我们对于细菌膜系统重塑过程的理解，还可以揭示细菌侵蚀宿主细胞时所展现的特有的抵抗力的机制。我们主要希望通过结构生物学的手段，解析LplT和Aas的蛋白结构，然后推测溶血磷脂的转运再利用机制和细菌膜系统完整性维持机制。. 本项目经过3年的研究，筛选了数十物种来源的LplT同源蛋白，二十余种纯化结晶去垢剂，最终获得了一个相对高分辨的LplT晶体，LplT晶体整体分辨率最终经过多轮优化停留在3.8Å，而且表现出严重的各向异性，其中一个轴分辨率高达2.3Å，而另外两个轴分辨率大约5Å，导致整体分辨率不佳。同时为了寻找相位我们尝试表达硒代甲硫氨酸晶体，虽然收集了数据，但是数据质量不佳，解析结构困难。AlphaFold2的问世最终缓解了这一困境，我们利用AlphaFold2构建了LplT的开关两个构型的模型，分别并用这两个模型做同源分子置换，最终正确构型的模型成功解析了该晶体结构，目前Rfactor 0.22 Rfree 0.3，还有待进一步精细优化，我们解析的结构是关闭状态，目前正在努力优化分辨率并且尝试做底物溶血磷脂和LplT的复合物结构，争取以两个构型的结构来发表该工作。同时相关的转运功能以及突变体实验也正在同步进行，文章发表尚需要至少1年。. 综上，本研究已经解析了LplT的晶体结构，后续仍需要一定程度优化晶体分辨率以及进行相关的转运体功能研究，从结构与生化两方面解析溶血磷脂在革兰氏阴性细菌中的转运机制，并且为以此为药物的设计提供思路。