猪流行性腹泻病毒3C样蛋白酶（3CLPro）调控MAVS介导的抗病毒信号通路的分子机制

The finding that the mitochondrial MAVS protein mediates type I interferon (IFN-I) production and virus-induced apoptosis underscores MAVS as a critical factor in viral infection and innate immunity. As a survival mechanism, viruses may evolve sophisticated strategies to inhibit innate antiviral defense and apoptotic responses by selective targeting to mitochondria or MAVS. Understanding the pathogenic mechanisms and host immune evasion strategies of PEDV is requisite in controlling infection. Over-expression of PEDV 3CLpro will be carried out to evaluate the effect of it on MAVS-mediated IFN-I production and apoptosis. Furthermore, site-directed mutagenesis, confocal microscopy and immunoprecipitations will be performed to elucidate the molecular mechanism by which 3CLpro affects MAVS-mediated induction of IFN-I and mitochondrial apoptosis. Finally, specific siRNA will be utilized to evaluate the effect of 3CLpro on virus-host interactions. This study will contribute to a more thorough understanding of the pathogenic mechanisms of PEDV, and may offer new strategies for the prevention and control of PEDV and other coronavirus infections.

线粒体蛋白MAVS能介导I型IFN产生及细胞凋亡，是细胞内整合病原刺激信号和机体应对反应信号的“枢纽”。病毒可以通过其编码的蛋白靶向MAVS或其介导的信号通路上的蛋白，摧毁宿主细胞的天然免疫防御体系或影响细胞的命运，为自身的增殖和扩散创造条件。为探讨PEDV 3CLpro在病毒与宿主互作中的作用及其促进病毒增殖的分子机制，本研究拟首先构建PEDV 3CLpro真核表达载体，通过过表达试验分析PEDV 3CLpro对MAVS介导的I型IFN产生及细胞凋亡的影响，并结合定点突变技术、激光共聚焦观察和免疫共沉淀试验，分析3CLpro分别调控MAVS介导的I型IFN产生及凋亡通路的靶位点及分子基础，然后通过RNA干扰试验整体验证PEDV 3CLpro对宿主细胞的天然防御体系的影响及两条途径（I型IFN产生及细胞凋亡）的时、效关系。研究对PEDV乃至其他冠状病毒的综合防控都具有重要的理论和现实意义。

线粒体蛋白MAVS能介导I型IFN产生及细胞凋亡，是细胞内整合病原刺激信号和机体应对反应信号的“枢纽”。病毒可以通过其编码的蛋白靶向MAVS或其介导的信号通路上的蛋白，摧毁宿主细胞的天然免疫防御体系或影响细胞的命运，为自身的增殖和扩散创造条件。为探讨PEDV 3CLpro在病毒与宿主互作中的作用及其促进病毒增殖的分子机制，本研究构建了PEDV 3CLpro真核表达载体，通过过表达试验、RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告系统等检测了RLRs/MAVS介导的I/III型IFN产生通路相关基因的表达及活性变化，分析了PEDV 3CLpro对MAVS介导的I/III型IFN产生通路的影响，发现3CLpro能通过抑制受体蛋白RIG-I、接头蛋白MAVS和TRAF3的基因转录、抑制RIG-I和TRAF3的蛋白表达，最终抑制I/III型IFN产生。同时，本研究通过Hoechst染色、电镜观察、流式细胞术及线粒体膜电位检测等，进一步发现PEDV 3CLpro能够诱导细胞凋亡，降低细胞活性，并引起线粒体膜电位显著下降；发现3CLpro能协同促进MAVS介导的凋亡发生，并且依赖于3CLpro的酶活性催化位点，但免疫共沉淀和CRISPR-Cas9等试验未发现二者有共定位或直接相互作用，推测3CLpro可能与通路上其他蛋白相互作用进而间接影响MAVS介导的细胞凋亡通路。进一步分析发现PEDV 3CLpro能激活NF-kB信号通路和诱导ROS产生，推测可能与3CLpro诱导凋亡产生有关。PEDV 3CLpro能够在病毒感染早期抑制I/III型IFN产生，有助于病毒早期感染和复制；同时在感染后期诱导细胞凋亡发生，有助于完整病毒粒子的释放，推测PEDV 3CLpro可能在病毒感染及增殖过程中发挥重要作用。另外，本研究利用生物信息学软件对PEDV 3CLpro进行序列分析、结构和功能预测，并通过分子对接技术预测小分子化合物与PEDV 3CLpro可能的结合位点，评价了3CLpro对病毒增殖的影响及小分子化合物可能的抗病毒作用机制，推测靶向3CLpro的特异性小分子化合物可能是有效的抗病毒药物筛选标的。本研究结果将有助于下一步研发小分子抗病毒药物及抗凋亡药物，对PEDV乃至其他冠状病毒的综合防控都具有重要的理论和现实意义。