巨噬细胞极化在蛛网膜下腔出血早期炎症反应中的作用及机制研究

Macrophages, as the main effector cells of innate immune response, play an important role in regulating the early-stage inflammation of subarachnoid hemorrhage (SAH). Previous studies have indicated that macrophages can be polarized to pro-inflammatory type M1 and anti-inflammatory type M2 under different pathological microenvironments. Our previous study showed that M1 macrophages predominate in the early stages of SAH, which aggravates the inflammatory response. RNA array detection found that PI3Kγ, STAT6, and NF-κB play an important role in the regulation of macrophage polarization. Therefore, we propose the following hypothesis: Peripheral macrophages infiltrated into injured brain tissues in the early stage of SAH and polarized into type M1, releasing proinflammatory cytokines and aggravating the early-stage inflammatory response. PI3Kγ can convert macrophages from type M1 to type M2 through phosphorylating STAT6 and inhibiting NF-κB, thus reducing the expression of the NLRP3 inflammasome and alleviating early brain injury. Our study intends to clarify the role and mechanism of macrophage polarization in the early-stage inflammatory response of subarachnoid hemorrhage from multiple dimensions such as molecular, cell, tissue and animal level. Our study is expected to provide a new target for the treatment of subarachnoid hemorrhage.

巨噬细胞作为先天性免疫反应的主要效应细胞，在调节蛛网膜下腔出血早期炎症反应中起到重要作用。先前研究发现在不同病理微环境下，巨噬细胞能极化为M1促炎型和M2抑炎型。我们前期研究发现与脑缺血性卒中相反，巨噬细胞在蛛网膜下腔出血早期以M1型为主，加重炎症反应。采用RNA array检测发现PI3Kγ、STAT6及NF-κB在调节巨噬细胞极化过程中起到重要作用。据此我们提出以下假说：外周巨噬细胞在SAH早期浸润至损伤脑组织并极化为M1型，释放促炎因子加重早期炎症反应，PI3Kγ能够通过磷酸化STAT6和抑制NF-κB表达从而促进巨噬细胞从M1型转化为M2型，从而降低NLRP3炎症小体的表达，减轻早期脑损伤。本课题拟从分子、细胞、组织以及动物水平等多个维度阐明巨噬细胞极化在蛛网膜下腔出血早期炎症反应中的作用及机制。本研究的开展有望为蛛网膜下腔出血的治疗提供新的靶点。

众多研究表明小胶质细胞介导的神经炎症与蛛网膜下腔出血病程进展密切相关。本研究采用血管内线栓穿刺法在成年C57BL/6小鼠中诱导蛛网膜下腔出血模型，采用免疫荧光技术等手段直接客观的检测神经炎症情况，明确了蛛网膜下腔出血后小胶质细胞介导的神经炎症作用。并在此基础上，流式分选出小鼠大脑中纯化小胶质细胞群(CD45C/CD11bC)进行转录组测序，并进行差异表达分析，鉴定出蛛网膜下腔出血后小胶质细胞活化的差异表达基因。研究结果表明，蛛网膜下腔出血早期脑损伤时期，小胶质细胞明显活化以M1促炎型为主，加重炎症反应。转录组分析提示SAH后小胶质细胞转录组学发生了强烈改变，有928个基因上调，648个基因下调。在参与免疫炎症反应的基因簇中，有17个基因的表达存在显著上调，上调的基因包括7个编码趋化因子的基因（Cxcl1、Cxcl2、Cxcl3、Cxcl10、Cxcl11、Cxcl14和Cxcl16）和10个编码细胞的基因（Ccl6、Ccl9、Il1b、Il23a、Ifng、Il33和Mif）。这些数据表明，SAH后的小胶质细胞释放出多种促炎的细胞因子和趋化因子，招募外周免疫细胞进入脑实质介导神经炎症。进一步分析数据库, 发现Irf7、Spib和Parp12的表达显著上调，而Nfkb1表达下调，随后，通过Iba1和IRF7的双重免疫荧光染色，我们证实了SAH后72 h的小胶质细胞诱导了Irf7的表达，利用CytoHubba对所选高频基因进行识别，并采用Degree算法计算前10位基因，Irf7是我们鉴定为转录因子的基因，此外Toll样受体2(Tlr2)也被认为是一个枢纽基因。免疫荧光染色证实了Tlr2与Irf7的相互作用，表明Tlr2 / Irf7信号轴可能介导SAH后小胶质细胞的免疫炎症反应和趋化性。此外，我们发现CCL17能够通过结合小胶质细胞上定位的受体CCR4激活mTORC2下游（pAKTSer473、pPKCSer657和pERK）磷酸化从而促进小胶质细胞从M1型转化为M2型，从而减轻早期脑损伤。上述结果证实小胶质细胞极化在蛛网膜下腔出血早期炎症反应中的作用及机制，调控小胶质细胞极化能有效改善蛛网膜下腔出血后的神经炎症及早期脑损伤，提高预后。